分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)（一）

分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)（一）
 
剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的小伙伴們，當(dāng)你們在進(jìn)行RNA的提取，RT-PCR和QPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否會有這樣的感受，明明是按照實(shí)驗(yàn)步驟往下做的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻不如人意，甚至很糟糕呢？小編我也曾經(jīng)被實(shí)驗(yàn)狠狠地虐過呢~為了減少實(shí)驗(yàn)對親們的打擊，在此獻(xiàn)上自己在實(shí)驗(yàn)過程中的一些小經(jīng)驗(yàn)，希望能幫助到各位小伙伴們~

（一）RNA提取篇

在RNA提取過程中，嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性，這是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。對于人、動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞等多種RNA的提取，Trizol法效果良好，可同時(shí)分離一個(gè)樣品內(nèi)的RNA/DNA/蛋白質(zhì)。Trizol裂解細(xì)胞，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。

如果對RNA純度要求極高或者樣品難以提取，也可以選擇使用RNA提取試劑盒。有同學(xué)用過國內(nèi)的天根，效果還好。小編曾用過Omega的RNA提取試劑盒，效果也挺好的，Promega的總RNA提取試劑盒對多種樣本的小量純化提取效果也還不錯(cuò)。

動(dòng)植物總RNA提取——Trizol法的具體步驟如下：

1、將組織物研磨后，取50-100mg加入至1mlTrizol中，充分混合裂解。樣品總體積最好不要超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫靜置5-10min后，加入200μl氯仿，蓋緊EP管，置于渦旋振蕩器上劇烈震蕩15s。然后冰上靜置10min。
3、于4℃，10000g離心15min，吸取上層澄清的液體500μl移至另一潔凈的EP管內(nèi)，并加入等體積（500μl）的異丙醇，輕輕混勻后靜置10min。
4、于4℃，10000g離心10min去上清。離心后可能在管壁或管底出現(xiàn)膠狀白色沉淀物，小心操作，避免沉淀物流失。
5、加入1ml 預(yù)冷的75%無水乙醇（DEPC水配置）至EP管內(nèi)，并用手指輕輕彈起沉淀物，然后4℃，10000g離心5min。
6、小心棄去上清液，于室溫靜置干燥2-5min，注意不能過分干燥。
7、將RNA溶于20-50μl DEPC水，必要時(shí)可55-60℃水浴3-5min。水浴過程中，EP管蓋需密閉。 所提RNA可用于后續(xù)試驗(yàn)或者保存于-80℃。

注意事項(xiàng)：

1、提取之前，將所需實(shí)驗(yàn)物品全部放置于超凈臺內(nèi)，并用祛RNA酶水噴灑臺面，紫外照射15min。
2、提取過程中均需佩戴口罩和手套操作，并經(jīng)常更換手套（一次性手套）。
3、提取過程中，超凈臺周圍應(yīng)盡量避免人員走動(dòng)，以免RNA酶趁虛而入進(jìn)入超凈臺。
4、樣品需充分勻漿裂解，否則易造成RNA提取量低。
5、步驟3中，離心管從離心機(jī)拿出來的時(shí)候要輕巧，以免管內(nèi)物質(zhì)震蕩導(dǎo)致下層沉淀激起。吸取上清的時(shí)候一定要?jiǎng)幼鬏p，切忌吸取太多，少量即可，吸到400-500μl就OK了，再多就容易碰到下層沉淀了。
6、步驟5中，一定把沉淀彈起來，讓浮在酒精中，然后放1-2min，讓酒精充分接觸沉淀，充分溶解有機(jī)試劑，然后再離心。但是有時(shí)也會使一些雜質(zhì)沉淀下來。
7、最后一步溶解RNA時(shí)一定要充分。組織提取出來的量還是挺大的，一般50μl左右。

接下來還有兩期分子生物學(xué)小經(jīng)驗(yàn)與大家分享，敬請期待！