生物制劑中宿主殘余DNA檢測技術與標準的發(fā)展趨勢

生物制品中殘留DNA檢測標準的變化

2015年3月底，中國食品藥品檢定研究院網站的國家藥品標準物質目錄中新增加了一個編號為410001的產品：CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。這個由中檢院與中科院聯合研發(fā)，由生物制藥企業(yè)參與標定的試劑盒與現行美國藥典（USP）建議的檢測方法同步，但與2010版藥典附錄中外源性 DNA 殘留量測定法有所不同，可能會對國內生物制品的研發(fā)和生產的上下游企業(yè)產生影響。

生物制品中宿主細胞殘留DNA具有潛在致瘤和傳染風險，所以各國藥品監(jiān)管部門對DNA雜質的限量要求非常嚴格。美國藥典在General Chapter <1130>介紹了三種常用技術，但將在2015年頒布的新版（USP38–NF33）中增加全新章節(jié)（General Chapter <30>）來進一步規(guī)范殘留DNA檢測的方法和標準物質。與1000號以上的章節(jié)不同的是，USP編號1000以內的章節(jié)詳細規(guī)定了檢測技術、系統(tǒng)適應性標準和標準物質。新版USP中將唯一推薦qPCR法作為生物制品中宿主殘留DNA的標準方法。qPCR法的技術優(yōu)勢在于序列特異性高、靈敏度高、重現性好、人為干擾因素少，可以為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質量控制方面提供可靠的檢測手段。

我國參照WHO、FDA和歐盟的標準，很早以前開始就對生物制品中殘余DNA含量進行限制。從衛(wèi)生部頒布的《人用重組DNA制品質量控制要點》到近年的《中國生物制品規(guī)程》都對DNA含量做了嚴格要求，部分標準高于國際標準。2010年版中國藥典附錄收錄了DAN探針雜交法和熒光染料法，這兩種方法都存在技術缺陷，很難達到雜質限量檢測的靈敏度，已經被歐美藥典摒棄。目前，仍有很多國內企業(yè)沿用這兩種方法檢測殘留DNA，致使生產工藝和產品質量很難達到國際一流水平。根據殘余DNA檢測技術的發(fā)展趨勢，小編預計我國2015版藥典或增補版本中將出現qPCR方法。企業(yè)在生產與研發(fā)中采用中檢院標準物質目錄中提供的試劑盒，可以大幅度減少費時、耗力、成本高昂的方法學考察，只需開展少量方法適應性實驗，就可以在生產工藝和質控體系的優(yōu)化方面發(fā)揮實際作用，同時滿足美國FDA相關標準的要求。同時，試劑盒聯合研發(fā)單位中科院湖州營養(yǎng)中心提供免費技術咨詢和培訓，幫助企業(yè)解決應用中的各種技術問題。

生物制品可用于治療和預防疾病，關系到患者和健康人的用藥安全，產品質量必須得到保障。我國藥品監(jiān)管部門對生物制品中殘留DNA的限量標準制訂的非常嚴格，但藥典修訂存在一定滯后性，附錄中的檢測技術與先進國家尚存在差距，企業(yè)在研發(fā)和生產中應具有一定前瞻性，否則會使改進工藝、提高質量、保障安全的努力大打折扣。

為什么要檢測殘余DNA？

生物制劑是制藥行業(yè)中發(fā)展最快的領域，2014年全球十大暢銷藥中7個是生物制劑。這些銷售上的重磅炸彈在臨床上療效確切，但研發(fā)成本高，生產和質量控制要求非常嚴格。絕大部分生物制劑是不經過胃腸道直接進入體內，所以除了生物活性外，監(jiān)管部門對藥品中雜質的限量要求非常嚴格。其中，宿主細胞殘留DNA因為具有特別的潛在安全風險，一直是國內外藥品監(jiān)管機構關注的重點。美國藥典會從2011年開始就組織專門小組討論修訂生物制品中殘留DNA檢測方法，并在2014年Prescription/Non-Prescription Stakeholder Forum Meeting#5上宣布將在2015年藥典修訂版中增加新的章節(jié)（General Chapter <30>）來規(guī)范檢測方法和標準物質。為什么美國藥典會的專家組花幾年時間討論一個微量成分（<100pg/劑量）的檢測方法？還要專門增加章節(jié)來規(guī)范化？回答這些問題，先要了解它的來源和潛在危害性。生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產品是用連續(xù)傳代的動物細胞株表達生產，雖然經過嚴格的純化工藝，但產品中仍有可能殘余宿主細胞的DNA片段。這些殘余DNA的片段大小和組成不定，而且潛在的風險也不定，可能帶來傳染性，或致瘤性，或免疫源性增加，或致突變等風險。比如殘留DNA可能攜帶HIV病毒或Ras癌基因；分布在哺乳動物細胞基因組的LINE-1序列可能發(fā)揮逆轉錄轉座子作用插入到染色體中，這種插入可能影響關鍵基因功能的發(fā)揮，比如激活癌基因或抑制抑癌基因；此外，由于微生物來源的基因組DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重組蛋白藥物在體內的免疫源性風險。目前的研究結果顯示，殘留DNA的致瘤性相比傳染性風險要低，但考慮到致瘤性實驗是動物實驗，傳染性實驗是在細胞水平做的，或許對兩方面的風險都不能掉以輕心。眾所周知，外源蛋白可能引起嚴重免疫反應，但關于殘留DNA誘導的免疫反應的研究還不多。在一些臨床前和臨床研究中報道了高劑量的核酸樣品，比如DNA疫苗或佐劑中的CpG寡聚核苷酸，可以誘導免疫反應，還誘導產生DNA抗體。

生物制品中宿主殘余DNA既是生產中帶來的雜質，還存在一定安全隱患。因此，WHO和各國藥物注冊監(jiān)管機構一般只允許生物制劑中存在100pg/劑量以下的殘留DNA，且鼓勵盡量降低殘余DNA的量和片段長度（小于一個功能基因的長度，按照目前的證據，大約為200bp）。根據雜質來源和工藝，特殊情況下最高允許10ng/劑量。

各種殘余核酸檢測技術的優(yōu)劣

正如前面講過，2015年版的美國藥典將新增章節(jié)對殘余DNA檢測進行規(guī)范化，那究竟和現有方法有什么不同？為什么最后只確定了一種方法？我們來看看現行美國藥典對于殘余DNA檢測的總體要求[General Chapter〈1130〉 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES—APPROACHES FOR DETECTING TRACE NUCLEIC ACIDS (RESIDUAL DNA TESTING)]�！�因為殘留DNA涉及到潛在來源（傳染性病毒DNA）、管理規(guī)程等關鍵問題，藥品監(jiān)管部門建議必須建立產品的DNA殘留檢測方法。不論是否成品的常規(guī)檢測包含DNA殘留含量檢測，還是工藝開發(fā)中已經證實了DNA清除率，殘留DNA技術指標和定量分析監(jiān)測規(guī)程都必須確立。分析方法包括雜交法、基于DNA結合蛋白的免疫色譜法（閥值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA擴增方法。理想的定量檢測方法的靈敏度應該能夠檢測到約10pg/劑量的殘留DNA。雜交法、閥值法和定量PCR方法因為靈敏度可以達到檢測要求，所以屬于經典方法�！�下面我們引用美國藥典（USP）<1130>的內容分別介紹一下這三種方法。

雜交法（Hybridization-based）：在這種方法中，根據宿主DNA序列設計DNA探針用于測定產品中配對DNA的數量。雙鏈DNA被變性成單鏈后固定在尼龍膜或硝化纖維膜上，DNA探針被隨機摻入標記以后，與膜上固定的樣品宿主DNA雜交結合，并在膠片或成像儀對應位置中顯現斑點。對于熒光標記的探針，斑點的光密度結果可以在儀器中定量分析。斑點光密度對應結合在目標DNA上的探針數，進而推測出殘留DNA的數量。通過目測方法可以半定量地檢測樣品中殘留DNA，儀器讀片可以對應斑點光密度繪制標準曲線，對應檢測結果更加準確。

DNA結合蛋白免疫閾值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：這種方法使用DNA結合蛋白和DNA抗體，分四步檢測。第一步，通過加熱把DNA變性成單鏈DNA，變性后DNA與偶聯了親和素的DNA結合蛋白以及偶聯了尿素酶的DNA單克隆抗體混合反應，液相中的單鏈DNA、DNA結合蛋白、DNA抗體共同形成序列非特異的復合物。第二步，樣品混合液通過生物素標記的膜，親和素-生物素結合把DNA復合物固定在膜上，洗去非特異吸附。第三步，膜放入檢測儀器中與尿素溶液反應，反應產物氨改變溶液pH值并被儀器記錄變化。這種pH值的變化直接與樣品中的DNA數目相關。第四步，儀器軟件自動分析原始數據確定樣品中殘留DNA數量。

定量PCR法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR方法以其快速、高通量的特點已經被應用于生物制藥的一些領域（拷貝數檢測與病毒檢測）。這項技術能夠確定各種樣品中目標DNA序列的準確數量。DNA探針的設計非常關鍵，這種DNA探針包含一端染料分子和另一端淬滅分子。當特殊設計的DNA引物引導DNA聚合酶沿著模板序列復制合成另一條對應序列時，DNA聚合酶切斷結合在目標DNA上的探針染料端，釋放到反應液里的染料信號被儀器測量。經過數十個循環(huán)的DNA擴增，熒光信號與起始DNA模板成對應關系，對應標準曲線可以準確計算出樣品中殘留DNA的數量。

美國藥典附錄進一步對三種方法進行了應用評價。雜交法可以序列特異性地檢測目標DNA，但³²P標記的探針因為存在半衰期短、放射等問題，實際應用并不廣泛。熒光標記的探針如果采用儀器讀取信號，雜交法理論上可以達到定量檢測要求的靈敏度，但是檢測時間需要48小時。閾值法因為是采用DNA抗體的非特異序列免疫檢測技術，不能特異性識別宿主殘留DNA序列，且容易受到環(huán)境和操作人員的DNA污染，導致讀值偏高。qPCR法具有序列特異性，靈敏度、準確度、精密度都好，還可以高通量篩選，但開發(fā)一個合格的q-PCR試劑檢測宿主殘留DNA并不是件容易的事情。有人會提出疑問，終產品中應該限定任何物種的DNA殘余以確保安全性，所以閾值法是不是最合理的分析方法？這里還需要強調一下宿主殘余DNA檢測的目的：1.確認純化工藝合理，能有效去除宿主DNA殘余；2.確認產品中雜質含量符合標準要求。非特異性的DNA檢測結果不能區(qū)分究竟是生產中污染、檢測污染、或是工藝缺陷引起的DNA殘余，就無法為解決方案提供有效信息。在嚴格的生產體系中，殘留DNA檢測是解決工藝合理性問題，任何外源污染問題都歸SOP或GMP管理體系解決。最后，經典的殘留DNA檢測方法靈敏度不同，qPCR法、DNA結合法、雜交法的檢測限分別達到<1、3、6pg/樣品的水平（目前qPCR法靈敏度可達10fg/反應），但是技術上限制，要求待測DNA片段分別不能小于50、150、600bp才能用于雜交法、q-PCR法、閾值法檢測，而WHO和FDA可接受的DNA 限度內的片段長度<200bp。由此可見，這三種方法中，qPCR法的適用性和技術指標最好。從qPCR技術原理來看，Taqman法要優(yōu)于熒光染料隨機摻入的SYBR Green法。正如前面介紹的USP修訂內容，經過幾年來對三種檢測方法的系統(tǒng)研究和應用反饋，美國藥典會將在新版藥典中唯一推薦qPCR法作為生物制品殘留DNA檢測的標準方法。

我國生物制品中殘余DNA檢測標準與技術

我國參照WHO、FDA和歐盟的標準，很早以前開始就對生物制品中殘余DNA的含量進行限制。酵母、大腸桿菌表達的生物制品限定不超過10ng/劑，CHO和vero細胞表達的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過100或10pg/劑。2010年版中國藥典附錄收錄了DNA 探針雜交法和熒光染料法作為殘余DNA檢測方法。以地高辛標記斑點雜交法為代表的DNA雜交法因為操作復雜，耗時較長，且只能半定量，在2014年美國藥典修訂版征詢意見稿中（ PF40(2)）中已經被剔除。以PicoGreen為代表的熒光染料法是基于熒光染料分子直接與雙鏈DNA結合后,經帶有熒光檢測功能的酶標儀激發(fā)后產生熒光信號，因為不能檢出單鏈DNA，且沒有序列特異性，以及靈敏度較低（>300pg）等原因，早已被歐美藥典摒棄。

我國2010版藥典及2015版藥典（附錄IX B 外源性 DNA 殘留量測定法）的征求意見稿中收載了的DNA探針雜交法和熒光染料法，而2009年美國USP就收錄了雜交法、閾值法和qPCR法，到2015年底USP將只收錄高靈敏度、高特異性的qPCR法作為殘留DNA檢測的推薦方法。由此可見qPCR法將成為國際公認的殘留DNA檢測方法，也可能會是我國下一版藥典的主要修訂內容。國內生物制品研發(fā)與生產企業(yè)，以及生產純化填料的上下游企業(yè)，盡早建立以qPCR方法為基礎的宿主殘余DNA檢測體系，將有利于改進工藝、提高產品質量，實現與歐美發(fā)達國家生物藥品標準的接軌。

國家標準物質庫中的試劑盒技術性能

為了提升國內企業(yè)和監(jiān)管部門對生物制品中宿主殘余DNA的檢測技術水平，實現與國際標準的接軌，中檢院聯合中科院、生產與研發(fā)企業(yè)開發(fā)了首個基于qPCR技術，具有自主知識產權的國產CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒。研發(fā)中除了常規(guī)方法學研究和穩(wěn)定性考察，還開展了DNA碎片化、種屬特異性、不同儀器的通用性、高蛋白、低pH、高鹽、國外同類產品性能對比等研究，并在驗證試驗中考察了對國內多家生產企業(yè)和研發(fā)企業(yè)不同樣本基質的適用性。由中檢院采用國家標準物質CHO細胞DNA標定并驗證的試劑盒提供了從樣品提取、純化到PCR檢測的整套試劑，檢測限達到10fg/rxn，抗人、大鼠、小鼠等基因組干擾，內標加樣回收率在70~130%（新版美國USP的標準將調整為50~150%），可以為CHO細胞表達的不同品種、不同劑量的生物制劑提供靈活、準確的DNA限量檢測。試劑盒具有2年保質期，并由聯合研發(fā)單位中科院湖州營養(yǎng)中心提供免費技術咨詢、操作培訓和方法學驗證服務，幫助企業(yè)盡快掌握該技術。中檢院和中科院湖州營養(yǎng)中心的聯合研發(fā)項目還將陸續(xù)推出E.coli、Yeast和vero細胞殘余DNA檢測試劑盒，為國內生物制藥產業(yè)的發(fā)展、為監(jiān)管部門制訂國家標準提供技術支持。