腸出血性大腸桿菌O157核酸檢測(cè)試劑盒（一管式PCR-熒光探針?lè)ǎ┦褂谜f(shuō)明書(shū)

腸出血性大腸桿菌O157核酸檢測(cè)試劑盒（一管式PCR-熒光探針?lè)ǎ?/p>

◆ 產(chǎn)品說(shuō)明

致病菌檢測(cè)系列可針對(duì)食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，自動(dòng)判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于腸出血性大腸桿菌O157的檢測(cè)。檢出限為10³ CFU/ml。

◆ 產(chǎn)品組成（96測(cè)試）

011052LⅡ
試劑	含量
A-O157-P	20μL × 8管× 12排
NG-P	100μl× 3支
PG-O157-P	100μl× 2支

◆ 適用儀器

   ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機(jī)；④渦旋混勻器；⑤金屬�。虎蘧�質(zhì)機(jī)、攪拌機(jī)或研缽等研磨器具；⑦電子天平。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨(dú)立使用工具，需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測(cè)頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開(kāi)蓋易造成氣溶膠污染，禁止開(kāi)蓋。

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

參照 《GB/T 4789.36-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)》中的5.1處理樣品，對(duì)樣品進(jìn)行前增菌，制備的菌液保存待用。

樣品采集后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，可在2℃~4℃保存18h。以無(wú)菌操作取檢樣25g（ml）加入到含有225ml mEC+n肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min；或放入盛有225ml mEC+n肉湯的均質(zhì)杯中，8000 rpm/min～10000 rpm/min均質(zhì)1min~2min, 于36 ℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

1. 模板制備（樣本制備區(qū)）

建議使用試劑配套細(xì)菌組DNA提取系列產(chǎn)品，具體過(guò)程詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

2．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

剪下所需測(cè)試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開(kāi)封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序?yàn)镹G、待測(cè)樣品模板、PG-O157-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。

按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

PCR循環(huán)			熒光收集位點(diǎn)
95℃	3分鐘	1個(gè)循環(huán)	—
94℃	5秒	40個(gè)循環(huán)	—
60℃	40秒		※

4.基線和閾值設(shè)定

  基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值線應(yīng)超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。

◆ 結(jié)果判定

檢測(cè)樣品無(wú)Ct值或≥40.0，曲線為直線或輕微斜線，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性，不含有腸出血性大腸桿菌O157或含量低于檢測(cè)限；

檢測(cè)樣品Ct≤35.0，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽(yáng)性，含有腸出血性大腸桿菌O157；

檢測(cè)樣品35.0＜Ct＜40.0，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若Ct值≥40.0則為陰性，否則為陽(yáng)性。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值＜30，此次檢測(cè)結(jié)果有效，否則無(wú)效。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為無(wú)效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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