牛源性成分核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書

牛源性成分核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產(chǎn)品說明

           物種鑒定系列可針對食品、飼料等樣品中動物源性成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于牛源性成分的檢測，檢出限為0.1%。

◆ 產(chǎn)品組成（48測試）

• 適用儀器

    ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

 ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴。

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

參照《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中動物源性成分的測定 實時熒光PCR法》或其他標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，制備的樣本保存待用。

樣品的采集和制備是動物源性鑒別的重要步驟，為防止交叉污染，應(yīng)使用一次性消耗品，研缽應(yīng)經(jīng)160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應(yīng)使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。

取樣應(yīng)盡量采取肌肉組織，對于同一批樣品，應(yīng)多點采集合并后，作為一份樣品進行均質(zhì)，提取DNA。

采樣過程應(yīng)快速完成，將采取的樣品迅速放入組織攪碎機中進行均質(zhì)成糜狀，充分混勻，取0.1 g充分混勻的樣品，采用液氮研磨或均質(zhì)器均質(zhì)。

詳細步驟請按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

◆ 實驗操作

1.模板制備（樣本制備區(qū)）

  建議使用試劑配套動物基因組DNA提取系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。

2.添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒上進行）

  剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-牛源-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應(yīng)。

3.擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）

   使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。

   按下列條件設(shè)置擴增反應(yīng)：

4.基線和閾值設(shè)定

  基線調(diào)整取3-15個循環(huán)的熒光信號，閾值線應(yīng)超過陰性對照擴增曲線的最高點

◆結(jié)果判定

檢測樣品無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有牛源性成分或含量低于檢出限；

檢測樣品Ct≤35，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有牛源性成分；

檢測樣品Ct＞35，可直接報告樣品陰性，不含有牛源性成分或含量低于檢測限。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴增曲線，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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