植物Rubisco測定試劑盒說明書

植物Rubisco測定試劑盒
● 產(chǎn)品組成：Plant Rubisco Assay Kit

組分貨號	名稱	規(guī)格	貯存	運輸
PU1060-01	試劑1-Rubisco提取緩沖液（2×）	100 ml	4℃	常溫
PU1060-02	試劑2-10×Assay buffer	15 ml	-20℃	常溫
PU1060-03	試劑3-GAPDH（200×）	1 KU	-20℃	常溫
PU1060-04	試劑4-PGK（100×）	500 U	4℃	常溫
PU1060-05	試劑5-CPK（100×）	1 KU×2	-20℃	常溫
PU1060-06	試劑6-ATP（100×）	1.2 ml	-20℃	常溫
PU1060-07	試劑7-CrP（100×）	1.2 ml	-20℃	常溫
PU1060-08	試劑8-NADH（100×）	1.2 ml	-20℃	常溫
PU1060-09	試劑9-RuBP	1.4 ml×2	-20℃	常溫
PU1060-10	試劑10-酶溶解緩沖液	5 ml	-20℃	常溫
DE005	試劑11-滅菌水	100 ml	4℃	常溫
BSA-02	試劑12-BSA溶液 50mg/ml	5 ml	-20℃	常溫
DT0140P	試劑13-1MDTT（100×）	1 ml×2	-20℃	常溫
PC2030-01	蛋白酶抑制劑 植物樣品提取用(100×)	1 ml	-20	常溫

●     產(chǎn)品簡介：
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代謝中的重要的調(diào)節(jié)酶，是植物中最豐富的蛋白質(zhì)，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白50％～60％。

這里1分子CO₂被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可計算Rubisco的活性，由340nm吸光度的變化可計算NADH氧化的量。
為了使NADH的氧化與CO₂的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系統(tǒng)。

 按照一次使用0.5 ml 試劑1-Rubisco提取緩沖液（2×）計算，試劑盒可以測定200個樣品。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；液氮；研缽或其他研磨設(shè)備；1.5ml離心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度計；制冰機(jī)；低溫離心機(jī)
● 操作步驟：
一、 即用型Rubisco提取緩沖液配制：

	一個反應(yīng)配制體積	n個反應(yīng)配制體積
	1 ml	n×1 ml
Rubisco提取緩沖液（2×）	0.5 ml	n×0.5 ml
滅菌水	470 μl	n×470 μl
1 M DTT（100×）	10 μl	n×10 μl
BSA溶液50mg/ml	20 μl	n×20μl
蛋白酶抑制劑（100×）	10 μl	n×10μl

注：1. 即用型Rubisco提取緩沖液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，短期4℃中可以過夜保存。
2. 為增強(qiáng)Rubisco的穩(wěn)定性，提取緩沖液中可以加入蛋白酶抑制劑（Cat：PC2030）
二、 Rubisco樣品提�。�
1. 取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm²葉片（1分硬幣大�。┗�0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取緩沖液，顛倒混勻，冰浴放置5-10分鐘。
2.12000g4℃離心 10分鐘，上清即為Rubisco樣品提取液，常溫放置備用（不要冰浴或4℃放置，常溫放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco樣品提取液最好立即測定，不建議保存。
三、 Rubisco活性測定分析：
   1. 即用型酶溶解緩沖液配制：
      按照標(biāo)簽所示，在試劑10-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液，冰浴備用，-20℃保存。
2. 試劑3-GAPDH和試劑5-CPK按照標(biāo)簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
   3. 試劑4-PGK為硫酸銨懸浮液，4℃12000g離心5分鐘，去除上清（小心去除，可以保留少許上清，不要吸棄沉淀），沉淀中按照標(biāo)簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
4. 試劑9-RuBP：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：RuBP溶液穩(wěn)定性較差，用后-20℃保存，有效期3-4天，長期-80℃保存。
5. 試劑8-NADH：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：NADH穩(wěn)定性較差，用后-20℃貯存3-4天，長期-80℃保存。
6. 反應(yīng)體系MasterMix配制：

加入順序	組份	1ml反應(yīng)體系加入量	MasterMix配制 （測定n個樣品為例）
1	10×Assay Buffer	100 μl	n×100μl
2	滅菌水	795μl	n×795μl
3	ATP溶液（100×）	10 μl	n×10μl
4	CrP溶液（100×）	10 μl	n×10 μl
5	GAPDH溶液（200×）	5 μl	n×5 μl
6	PGK溶液（100×）	10 μl	n×10 μl
7	CPK溶液（100×）	10 μl	n×10 μl
8	NADH溶液（100×）	10 μl	n×10 μl

7. 反應(yīng)體系測定；
1.5 ml離心管中配制以下反應(yīng)。

	1	2	3
	對照反應(yīng)	初始活性測定	總活性測定
MasterMix	950 μl	950 μl	950 μl
即用型Rubisco提取緩沖液 （步驟一）	25 μl	-	-
Rubisco樣品提取液 （步驟二）	-	25μl	25μl 常溫放置15分鐘
試劑9-RuBP溶液	25 μl	25 μl	25μl
		加入RuBP后立即測定OD340讀數(shù)，記錄60秒內(nèi)OD340值變化。

注：一般分光光度計OD₃₄₀讀數(shù)在0.5-3之間數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確，低于此范圍說明提取用的材料太少，Rubisco活性太低；高于此范圍說明所用材料太多，Rubisco活性太高，此時可以將Rubisco樣品提取液用即用型Rubisco提取緩沖液稀釋后測定。
四、Rubisco活性計算：
根據(jù)如下公式計算樣品中Rubisco活初始性和總活性：

Activity（μmol·m^-2·S^-1）-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測定管吸光度變化的絕對值
N-稀釋倍數(shù)，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)
d-cm 比色皿光程，一般為1
△t-秒 測定時間，本程序為60秒
S-cm² 提取時使用的葉面積