真菌/酵母細胞高純線粒體分離試劑盒說明書

真菌/酵母細胞高純線粒體分離試劑盒
 
主要用途
 
真菌/酵母細胞高純線粒體分離試劑是一種旨在使用生物、化學(xué)和物理方法相結(jié)合，有效去除真菌/酵母菌細胞壁，進一步快速且充分裂解真菌/酵母菌細胞，從而分離出完整而高度純化的活性線粒體細胞器的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮培養(yǎng)或凍存的野生型或突變型真菌/酵母菌菌株細胞的活性線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達99％�？梢员挥糜诰�粒體酶活性、細胞凋亡、信號傳遞、能量代謝、蛋白組學(xué)和病理生理學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品最佳。
 
技術(shù)背景
 
線粒體細胞器的分離是現(xiàn)代細胞生物學(xué)研究的最常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過機械或化學(xué)方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
清理液（Reagent A）        250毫升
平衡液（Reagent B）   250毫升
酶解液（Reagent C）   500微升
裂解液（Reagent D）         40毫升
凈化液（Reagent E）    10毫升
強化液（Reagent F）     5毫升
保存液（Reagent G）   100毫升
活性液（Reagent H）   200微升
高純液（Reagent I）    55毫升
產(chǎn)品說明書     1份
 
保存方式
 
保存酶解液（Reagent C）、凈化液（Reagent E）和活性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，嚴(yán)格避免污染；高純液（Reagent I），避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50毫升錐形離心管：用于細胞收集后離心或清洗
1.5毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺式離心機：用于沉淀細胞
4℃超速離心機：用于分離細胞器成分
恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent E）和活性液（Reagent H）凍融，然后移出20微升活性液（Reagent H）和1毫升凈化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進行下列操作。
 

• 準(zhǔn)備好50毫升新鮮真菌/酵母菌樣品
• 在分光光度儀上測OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細胞/毫升；總量為5 X 10⁸細胞） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent C），混勻
• 放進30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續(xù)實驗步驟21
• 同時將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預(yù)冷30分鐘（注意：以下步驟在4℃環(huán)境下進行）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的平衡液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）、凈化液（Reagent E）和活性液（Reagent H）的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 選擇下列其中一種方法：

 
方法一：物理處理法

• 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20下）（注意：參見注意事項10）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃臺式高速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升保存液（Reagent G），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的高純液（Reagent I）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻高純液(Reagent I)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在高純液（Reagent I）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升保存液（Reagent G）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實驗步驟16至18一次
• 加入500微升保存液（Reagent G），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

 
方法二：化學(xué)處理法

• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的強化液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項11）
• 加入5毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃臺式高速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升保存液（Reagent G），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的高純液（Reagent I）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻高純液(Reagent I)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在高純液（Reagent I）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升保存液（Reagent G）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液

• （選擇步驟）重復(fù)實驗步驟18至20一次
• 加入500微升保存液（Reagent G），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

 
注意事項
 

• 本產(chǎn)品為10次操作（50毫升菌液：1克細胞濕重或5 X 10⁸細胞）
• 其它實際操作的細胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如10毫升菌液（OD600=1）：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液
• 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克
• 細胞生長條件影響線粒體的質(zhì)量：建議在有氧條件下富含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)
• 實驗步驟20以下的所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進行
• 建議使用足夠的細胞量
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為20下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 通常1克細胞濕重或5 X 10⁸細胞的線粒體含量為50微克線粒體蛋白，但不同菌株或培養(yǎng)條件會存在差異；建議使用純化線粒體蛋白質(zhì)濃度定量測定試劑盒（YJ10059）測定線粒體蛋白濃度
• 建議使用40000g以上離心速度；如果沒有條件，則不能低于30000g，離心時間增加為60至90分鐘

14． 如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解
15． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度（可達到99％）和產(chǎn)量最為理想
16． 使用高純液（Reagent I）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液
17． 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整高純液（Reagent I）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
18． 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆�，�?yán)格避免反復(fù)凍融

• 線粒體正�；钚詼y定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內(nèi)外膜完整性測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列真菌/酵母細胞線粒體試劑產(chǎn)品 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正�；钚�
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體純度達99％