雷帕霉素生物活性及實驗方法

雷帕霉素是一種特異性的mTOR抑制劑，IC50為0.1nM
In Vitro：雷帕霉素抑制HEK293細胞內(nèi)源性mTOR活性，IC50為0.1 nM，比iRap和AP21967更有效，IC50分別為5 nM和10 nM [1]。 雷帕霉素通過誘導(dǎo)自噬發(fā)揮其對惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的抗腫瘤作用，并且表明在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中PI3K / Akt信號傳導(dǎo)途徑的破壞可以極大地增強mTOR抑制劑的有效性。 雷帕霉素以劑量依賴性方式抑制所有三種細胞系中的細胞活力，但它們的敏感性變化。 T98G，U87-MG和U373-MG細胞的IC50水平分別為2 nM，1μM和>25μM[3]。
 
In Vivo：雷帕霉素（i.p，1.5 mg / kg）治療幾乎完全可以防止7天和14天跖肌重量和纖維大小的肥大增加[4]。 每天用雷帕霉素（2mg / kg體重，腹膜內(nèi)注射）治療WT或LS / +小鼠4周，然后每周注射相同劑量另外4周。 雷帕霉素處理的LS / +小鼠心臟的異常胎兒基因表達譜顯著逆轉(zhuǎn)[5]。
 
Kinase Assay：將HEK293細胞以每孔2-2.5×10 5個細胞接種于12孔板中，僅在DMEM中血清饑餓24小時。 將細胞模擬處理或用雷帕霉素（0.05-50nM），iRap（0.5-500nM）或AP21967（0.5-500nM）在37℃處理15分鐘。 在37℃下將血清加至終濃度為20％，持續(xù)30分鐘。 裂解細胞，通過SDS-PAGE分離細胞裂解物。 將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用針對p70 S6激酶的Thr389的磷酸特異性一抗進行免疫印跡。 使用ImageQuant和KaleidaGraph [1]分析數(shù)據(jù)。
 MCE尚未獨立確認這些方法的準確性。 它們僅供參考。
 
Cell Assay：HL-60，NB4，U937，KG-1和K562細胞常規(guī)傳代于RPMI-1640中，補充有10％熱滅活的FBS，2 mM L-谷氨酰胺，50 U / mL青霉素和50μg/ mL鏈霉素。 在37°C下，5％CO2加濕的氣氛。 對于實驗，通過離心收獲指數(shù)生長的細胞，并重懸于含有10％FBS的新鮮培養(yǎng)基中。 在各種濃度的DMSO或1μMATRA存在下，在BD Falcon六孔板中以2×10 5 / mL的初始細胞密度接種細胞。 在分化劑之前20分鐘加入雷帕霉素（20nM）。 在第2天，向每個孔中加入0.3mL新鮮培養(yǎng)基。 通過臺盼藍排除法測定活細胞，并使用血細胞計數(shù)器進行定量[2]。
 MCE尚未獨立確認這些方法的準確性。 它們僅供參考。
 
Animal Administration：大鼠[4]
將雌性Sprague-Dawley大鼠（250-275g），成年雌性SD大鼠（225-250g）隨機分配至治療組或媒介物組，使得每組的平均起始體重相等。藥物治療開始于手術(shù)當天或14天停藥后重新加載的第一天。雷帕霉素每天一次通過腹膜內(nèi)注射以1.5mg / kg的劑量遞送，溶解在2％羧甲基纖維素中。 CsA每天一次通過皮下注射以15mg / kg的劑量遞送，溶于10％甲醇和橄欖油中。 FK506每天一次通過皮下注射以3mg / kg的劑量遞送，溶于10％乙醇，10％的cremophor和鹽水中。
小鼠[5]
將雷帕霉素以20mg / mL的濃度溶解在乙醇中，過濾滅菌，以1mg / mL的濃度重懸浮于載體（0.25％PEG，0.25％吐溫-80）中，并腹膜內(nèi)注射。 （2mg / kg體重），每天持續(xù)4周或每天持續(xù)4周，然后每周注射另外4周。注射開始于8周（肥大發(fā)作前）或12周（指示確定肥大后），并在治療4周后或治療8周后評估小鼠，詳見結(jié)果和圖例。 。作為對照，WT和LS / +小鼠僅用載體處理。
 MCE尚未獨立確認這些方法的準確性。它們僅供參考。