萬(wàn)能溶劑DMSO的使用誤區(qū)

導(dǎo)讀
在前幾期我們?yōu)榇蠹医榻B了藥物溶解的各種配方及策略，其中不被推薦的DMSO也作為助溶劑占有一席之地，然而卻頗受爭(zhēng)議。這個(gè)被FDA限制使用，廣傳毒性很大的溶劑，究竟毒性有多大，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中如何使用？今天我們就為大家揭曉，“萬(wàn)能溶劑”的DMSO，在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的正確使用方法。

DMSO簡(jiǎn)介

二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）是一種含硫有機(jī)化合物，結(jié)構(gòu)如下圖所示。

物理性質(zhì)：常溫下為無色無臭的透明液體，具有強(qiáng)烈的吸濕性，凝固點(diǎn)為18.55℃，密度與水接近為1.100 g/mL；

化學(xué)性質(zhì)：分子式為（CH₃）₂SO，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)中具有一個(gè)親水的亞硫�；�和兩個(gè)疏水的甲基，它既可與水溶液也可與除石油醚外的大多數(shù)有機(jī)溶劑互溶；可以溶解約80%的化合物，大部分的水溶性化合物和脂溶性化合物都可被其溶解，所以DMSO又被譽(yù)為“萬(wàn)能溶劑”。

DMSO的發(fā)展史

DMSO在剛發(fā)現(xiàn)階段因其廣泛的用途被稱為“神藥”，科學(xué)家進(jìn)行了大量研究，主要包括消炎止痛，利尿，鎮(zhèn)靜等作用，在早期醫(yī)藥工業(yè)中，DMSO可直接用作某些藥物的原料及載體，也可作為一種滲透性保護(hù)劑，血小板冷凍保存劑等。

然而，1965年，美國(guó)對(duì)DMSO的研究突然被叫停，因?yàn)镕DA和一些制藥公司參加的關(guān)于DMSO的研究討論會(huì)指出，發(fā)現(xiàn)DMSO影響了許多哺乳動(dòng)物的晶狀體結(jié)構(gòu)，但在人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中并未發(fā)現(xiàn)有此改變。

如下圖為DMSO的發(fā)展歷程：可以看到自1965年后，科學(xué)家對(duì)DMSO毒性進(jìn)行了廣泛研究，不過并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)健康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體有嚴(yán)重毒副作用，但是卻對(duì)細(xì)胞毒性較大，因此DMSO被FDA限制在非特殊非不可替代情況下不能使用。

DMSO近幾十年的發(fā)展史

DMSO的毒性到底有多大?

1. DMSO的細(xì)胞毒性：需要控制＜0.1%（v/v）

• 2008年，Qi Weidong等人的研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中含0.1 %-0.25 %（v/v）的DMSO時(shí)，24h內(nèi)對(duì)大鼠茸毛細(xì)胞沒有損傷和影響，但是培養(yǎng)液中DMSO含量到達(dá)0.5 %-6 %時(shí)，茸毛細(xì)胞出現(xiàn)了損傷，以及劑量依賴性的細(xì)胞死亡[2]。

• 2014年賀兵等人的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞體外培養(yǎng)基中不同濃度的DMSO含量對(duì)體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的影響，使用濃度為2.0%（v/v）時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞顯現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，但在0.1%-1.0%濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響很小[4]。

2. DMSO的酶毒性：需要控制＜0.1%（v/v）

• 2011年Ramakrishna Nirogi等人的研究發(fā)現(xiàn)，在人肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)中，孵育體系中0.1 %含量以上的DMSO能夠抑制人肝微粒中CYP1A2的活性。但是2 %濃度的甲醇或者乙腈對(duì)酶活性沒有影響[5]。

• 2003年，Masuhiro NISHIMURA等人研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)人肝細(xì)胞進(jìn)行化合物給藥時(shí)，DMSO的終濃度在0.1%或者更低水平時(shí)對(duì)肝細(xì)胞中藥物一相代謝酶細(xì)胞色素P450酶亞型（CYPs）、細(xì)胞中二相藥物代謝酶葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶亞型（UGTs）以及主要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATPBing Cassttee Transporters）的表達(dá)量沒有影響，濃度再高時(shí)則會(huì)改變其表達(dá)情況[6]。

3. DMSO的動(dòng)物毒性

（1）急性毒性：指機(jī)體一次性大劑量接受某種藥物后所產(chǎn)生的快速而劇烈的中毒反應(yīng)，包括死亡效應(yīng)；一般可獲得藥物的半數(shù)致死量 (LD₅₀，即在標(biāo)準(zhǔn)條件下一次給藥DMSO (g/kg）必然引起50%的測(cè)試動(dòng)物死亡的劑量)來評(píng)估危險(xiǎn)性。在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有以下結(jié)果：

下表列出了各給藥方式下各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的DMSO半致死劑量，從表中其實(shí)可以看出DMSO的LD₅₀ 其實(shí)較高，如小鼠口服給藥LD₅₀是16.5-24.6g/kg，而我們小鼠實(shí)驗(yàn)中給藥劑量一般都是以mg/kg為單位，所以幾乎不可能超過這個(gè)劑量，也就是說對(duì)動(dòng)物整體毒性沒有細(xì)胞那么強(qiáng)。不同實(shí)驗(yàn)室提供的數(shù)據(jù)也許不完全相同，但都證實(shí)了DMSO 的動(dòng)物低毒性。

不同物種不同給藥方式下的DMSO半數(shù)致死量(g/kg) [3]

（2）長(zhǎng)期毒性：指藥物以一定的等級(jí)劑量連續(xù)多日給予受試動(dòng)物所產(chǎn)生的有害作用。在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有以下結(jié)果：

1. DMSO的給予劑量為5 g/kg.d的狗、豬和兔子等動(dòng)物的給藥實(shí)驗(yàn)也表明，數(shù)月后動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)晶狀體屈光度的改變而不是渾濁，而且，這種改變是呈劑量依賴性的關(guān)系，DMSO劑量減低，晶狀體屈光度的改變程度很小；靈長(zhǎng)類動(dòng)物(包括人)至今均未發(fā)現(xiàn)該種副作用反應(yīng)[7];

2. DMSO給予劑量為9 g/kg·d，持續(xù)給予18個(gè)月的恒河猴給藥實(shí)驗(yàn)表明，恒河猴無明顯異�；虿荒褪躘8]；

3. DMSO給予劑量1g/kg·5d/week，持續(xù)給藥12個(gè)月的雌雄大鼠實(shí)驗(yàn)表明，大鼠各組織器官如：大腦、心臟、腸道、生殖系統(tǒng)、甲狀腺等均正常，未見明顯異�；虿荒褪躘 [9]。

4. DMSO有利尿的作用，但是在人類和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物研究中未發(fā)現(xiàn)其有腎臟損害。

從以上毒理數(shù)據(jù)可以看出相對(duì)于其他安全無毒的溶劑來說，DMSO雖然有一定的毒性，但是DMSO也有其自身的獨(dú)特的性質(zhì)，在沒有找到更好的細(xì)胞防凍劑和通量更高的“萬(wàn)能溶劑”之前，生物實(shí)驗(yàn)和藥物初篩階段也可以通過合理的使用DMSO來快速的做出正確的無試劑因素干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下面就看看如何在實(shí)驗(yàn)中正確使用DMSO。

一、DMSO在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中如何正確使用？

DMSO在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中主要有兩方面的運(yùn)用：

1. 細(xì)胞凍存劑    DMSO是目前最好的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，但又有一定的毒性。一般使用時(shí)濃度控制在終體積10%以下，對(duì)于耐受力弱的細(xì)胞可以再降低到10%以下，如8%。注意細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)要盡快洗掉二甲基亞砜，否則會(huì)造成細(xì)胞嚴(yán)重的毒性。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)液中DMSO濃度為10 %時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率近100 %；1%濃度時(shí)抑制率為35%，即使是0.04 %的濃度，DMSO對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也有不利的影響[10]。 

2. 細(xì)胞給藥時(shí)化合物的溶劑    DMSO在細(xì)胞給藥溶解化合物時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制DMSO的使用劑量：不同細(xì)胞可能對(duì)DMSO含量的敏感程度不一樣，但是現(xiàn)在比較能接受的是采用DMSO配制化合物進(jìn)行細(xì)胞給藥時(shí)，DMSO的終濃度控制在0.1%以內(nèi)是被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)沒有干擾的，即1ml培養(yǎng)基中，DMSO體積不能超過1μl。如果發(fā)現(xiàn)體積超過這個(gè)比例，我們可以通過提高藥物濃度， 或者采用水相多步稀釋法來降低DMSO的使用量。

二、DMSO在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中如何正確使用?

DMSO在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用主要在于藥物溶解，前幾期我們介紹到藥物的溶解方式（可參考文末鏈接），但是藥物溶解時(shí)我們必須首先考慮助溶劑的毒性，再考慮溶解性，如果超過了毒性比例才能溶解藥物，我們就必須舍棄這一溶解方法。

從上述毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，我們看到DMSO對(duì)動(dòng)物整體的毒副作用遠(yuǎn)小于細(xì)胞，所以Li Ping等人也認(rèn)為在動(dòng)物給藥時(shí)DMSO的使用量可占給藥總體積的10 %-20 % [11]，如口服給藥時(shí)小鼠的給藥體積為10mL/kg，對(duì)于20g的小鼠，我們單次給藥體積約為100-200μl，DMSO體積必須控制在10%-20%，即20-40μl

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中DMSO推薦體積[11]

注：DMSO使用體積僅供參考，如果動(dòng)物出現(xiàn)不良癥狀，如體重減輕/食欲下降等，我們應(yīng)該考慮降低DMSO的使用量，總的原則還是盡量減少DMSO的使用。

DMSO使用中的注意事項(xiàng)

1. 避免皮膚接觸：研究發(fā)現(xiàn)：DMSO分子量小，容易經(jīng)皮膚吸收，若皮膚長(zhǎng)期接觸DMSO會(huì)表現(xiàn)出了較小的局部刺激反應(yīng)，如；局部的皮膚刺激反應(yīng)、瘙癢、燒灼感。實(shí)驗(yàn)時(shí)可以準(zhǔn)備1%-5%的氨水備用，皮膚沾上之后要用大量的水以及稀氨水洗滌；同時(shí)也應(yīng)要避免接觸含有其他毒性物質(zhì)的二甲基亞砜溶液，因二甲基亞砜會(huì)滲入肌膚，在一定條件下會(huì)將有毒物質(zhì)帶入肌膚；

2. 避免吸入DMSO：吸入DMSO最為常見的為惡心、嘔吐、和呼出的氣體中發(fā)出大蒜、洋蔥、牡蠣味。高濃度大面積使用能影響神經(jīng)機(jī)能和導(dǎo)致溶血，用的時(shí)候要避免其揮發(fā)。

綜上所述，是我們本期為大家介紹的關(guān)于DMSO的基本知識(shí)及其實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用方法，是否讓你對(duì)DMSO有了一個(gè)全新的認(rèn)識(shí)呢？雖然DMSO存在一定的毒性，但并非不可用；在我們沒有找到合適的替代物時(shí)，將DMSO適量地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)獲得研究數(shù)據(jù)還是被許可的。如果你有不同的聲音和意見，歡迎給我們留言或者參與到下方群聊，一起討論吧！

 

參考文獻(xiàn)

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