抗性淀粉（RS）檢測(cè)試劑盒使用說明書

抗性淀粉（RS）檢測(cè)試劑盒使用說明書
抗性淀粉（RS）是指在人小腸內(nèi)不能被酶解的淀粉，在大腸部分或完全發(fā)酵。RS是總膳食纖維的組分之一。
原理（AOAC法 2002.02 ;AACC法32-40）
  抗性淀粉的測(cè)定方法： 樣品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振蕩水浴孵育16小時(shí)，在這期間，通過兩種酶的聯(lián)合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育結(jié)束后，加入等體積的乙醇或工業(yè)甲基化酒精（IMS,變性乙醇）終止反應(yīng)。離心上述溶液，收集上清勿棄，底部殘留絮狀團(tuán)即為樣品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗滌絮狀團(tuán)，洗滌后離心，再重復(fù)一次洗滌離心，收集離心后獲得的上清，與之前收集的上清混合。小心倒出試管殘留的液體，將絮狀團(tuán)置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同時(shí)用磁力攪拌機(jī)劇烈攪拌。用醋酸鹽緩沖液將這個(gè)溶液調(diào)至中性，用AMG將淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD）測(cè)定，這也是對(duì)樣品中RS含量的測(cè)定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的測(cè)定可通過集中的上清液并定容至100mL，再用GOPOD測(cè)定D-葡萄糖完成。
應(yīng)用性和精確性
   這個(gè)方法需要樣品中RS含量多于2% w/w。如RS含量多于2% w/w，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)誤差為+5%。少于2% w/w RS的誤差更高。
試劑盒
  瓶子1：淀粉葡糖苷酶AMG，12 mL，3300U/ mL，條件為pH4.5，40℃下，底物為可溶性淀粉，[單位或?yàn)?00U/mL，條件為pH4.5，40℃下，底物為對(duì)硝基苯基β-麥芽糖苷]。AMG溶液應(yīng)完全沒有可檢測(cè)到的游離D-葡萄糖。4℃下穩(wěn)定性> 3年。
  瓶子2：α-胰淀粉酶(胰酶，10g，3Ceralpha U/mg)。4℃下穩(wěn)定性> 3年。
瓶子3：GOPOD 試劑緩沖液。磷酸鉀緩沖液（1M，pH7.4），對(duì)羥基苯甲酸（0.22M）和疊氮化鈉（0.4%W/V）。4℃下穩(wěn)定性> 3年。
瓶子4：GOPOD試劑酶。葡糖氧化酶（>12,000U）加上過氧化物酶（>650U）和4-氨基安替比林（80mg）。凍干粉，-20℃下穩(wěn)定性>5年。
瓶子5：D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL,1.0mg/mL）溶于苯甲酸0.2%（w/v）。室溫下穩(wěn)定性>5年。
瓶子6：抗性淀粉對(duì)照�？剐缘矸酆�量如表所示。室溫下穩(wěn)定性>5年。
溶液/懸浮液的制備
1.使用瓶子1中提供的的產(chǎn)品（AMG；溶液1）。這個(gè)溶液是有粘性的，因此應(yīng)使用正向移液器？？2ml的，一個(gè)（或其他功能相同的裝置）移取分裝。4℃下穩(wěn)定性> 3年。
稀釋AMG（300 U/ mL）。取2 mL瓶子1中的AMG濃縮液用0.1M順丁烯二酸鈉緩沖液（0.1M，pH6.0下面有清楚解釋怎么調(diào)pH；試劑1，非提供）稀釋至22mL。以5 mL為單位分裝后用聚丙烯管？？？冷凍保存。反復(fù)凍融不會(huì)影響穩(wěn)定性，穩(wěn)定性-20℃>5年。
用前制備
2.用100mL順丁烯二酸鈉緩沖液(100mM，pH6.0；試劑1，非提供)懸浮1g？？？怎么取？瓶子2中的產(chǎn)品(α-胰淀粉酶)，攪拌5分鐘。加入1.0mL稀釋的AMG（300 U/ mL），混勻。>1500g離心10分鐘，慢慢倒出上清液，這就是制備的溶液2。溶液2制備后應(yīng)當(dāng)天使用。
3.用蒸餾水稀釋瓶子3中的產(chǎn)品（GOPOD 試劑緩沖液）稀釋至1L，這就是制備的溶液3。制備后馬上使用。全部用，下一步里有
備注：
（1）如果濃縮緩沖液在-20℃下儲(chǔ)存，它將形成結(jié)晶鹽，因此必須要完全溶解才可以用蒸餾水稀釋。
（2）這個(gè)緩沖液包含0.4%（w/v）的疊氮化鈉。因此這是個(gè)有毒化學(xué)物，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的處理。
4.取瓶3中制備好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的產(chǎn)品，定量轉(zhuǎn)移這個(gè)溶液至裝有剩余溶液3的瓶子中。用鋁箔封蓋瓶子以遮光。這就是葡萄糖測(cè)定試劑（GOPOD 試劑），可以在2-5℃保存3個(gè)月或者-20℃下保存一年。
如果試劑要以冷凍態(tài)儲(chǔ)存，應(yīng)分裝后再凍存。
 當(dāng)試劑是新鮮制備的，它的顏色應(yīng)是淺黃色或淺粉色。在4℃儲(chǔ)存2-3個(gè)月時(shí)會(huì)演變成深粉色。當(dāng)以蒸餾水為對(duì)照時(shí)，這個(gè)溶液的吸光度應(yīng)小于0.05。
 5&6.使用瓶子5或6提供的產(chǎn)品。室溫下穩(wěn)定性>5年。
沒有提供的試劑（應(yīng)購(gòu)買分析純級(jí)）：
1.順丁烯二酸鈉（馬來酸鈉）緩沖液(100mM，pH6.0)加上5mM二水氯化鈣和疊氮化鈉（0.02%w/v）.
用1600mL蒸餾水溶解23.2g順丁烯二酸，用4M（160g/L）氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0，加入0.74g二水氯化鈣和0.4g疊氮化鈉，并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。
2.醋酸鈉緩沖液（1.2M，PH3.8）
將69.6mL的冰醋酸（1.05g/mL）加至800 mL的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至pH3.8。用蒸餾水定容至1L，室溫下可保存一年。
3.醋酸鈉緩沖液（100mM，PH4.5）
將5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.5。用蒸餾水定容至1L，4℃保存2個(gè)月。
4.氫氧化鉀溶液（2M）
將112.2gKOH加至900 mL的去離子水中，攪拌溶解。定容至1L，密封保存。室溫下可保存2年。
5.含水乙醇（或者IMS）（大約50%v/v）
將500mL乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工業(yè)甲基化酒精（IMS；變性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500mL的水中。密封保存，室溫下穩(wěn)定保存>2年。
 備注：
 一系列包含RS的對(duì)照樣品0.6%-78%w/w可從Megazyme公司購(gòu)買。
設(shè)備（推薦）：
1. 離心式粉碎機(jī)，帶有齒輪轉(zhuǎn)子和1.0mm篩子，或類似的裝置。小型樣品可選擇旋風(fēng)磨碎機(jī)替代。
2.絞肉機(jī)-手動(dòng)或電動(dòng)的，裝有4.5mm篩。
3.臺(tái)式離心機(jī)-能夠放入16×120mm玻璃試管，速度大約1500g(3000rpm)
4.振蕩水浴器，可設(shè)定為每分鐘100次直線運(yùn)動(dòng)（振蕩速度為每分鐘200里程），振蕩距離35mm,37℃。
5.水浴鍋-能夠保持在50+0.1℃。
6.渦旋混勻器。
7.磁力攪拌器。
8.磁力攪拌棒-5×15mm。
9.pH計(jì)
10.計(jì)時(shí)器
11.分析天平（精確到0.1毫克）
12.分光光度計(jì)-能夠設(shè)定510nm（10mm路徑長(zhǎng)度）
13.100μL移液器及一次性槍頭
14.連續(xù)分配器-配有50mL管嘴，能夠移取2.0mL，3.0mL和4.0mL。
15.培養(yǎng)管-螺旋帽，16×125mm
16.玻璃試管-16×100mm，14mL容量
17.塑料盒，可放置試管架，也可作為冰盒使用。
18.溫度計(jì)-能夠讀取37+0.1℃和50+0.1℃。
19.容量瓶-100mL，200mL，500mL，1L，2L