原代細胞轉(zhuǎn)染小核酸siRNA等操作步驟和注意事項

原代細胞相對普通傳代細胞要難轉(zhuǎn)染，但用對了試劑一樣可以擁有很高的轉(zhuǎn)染效率和實驗結(jié)果，下面以RFect為例，簡單介紹下原代細胞轉(zhuǎn)染的操作步驟和注意事項。

原代細胞轉(zhuǎn)染操作步驟（以24孔培養(yǎng)板為例）：
A. 細胞接種：轉(zhuǎn)染前一天接種細胞，每孔500 μl培養(yǎng)基（不可加抗生素），使細胞在轉(zhuǎn)染時密度在30-50%。
B. siRNA-RFectPM混合物準備：
1.6pmol siRNA 用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。
2.2μl RFectPM用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻，室溫孵育5min。注意：確保在25 min內(nèi)執(zhí)行第三步操作，不要過于延遲。
3.孵育5min后，將siRNA 稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻，室溫孵育20 min。
C. 將混合物加到培養(yǎng)的細胞內(nèi)（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）：
1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi)，培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細胞。輕輕晃動培養(yǎng)板，混勻。
2.37°C培養(yǎng)18-72h，檢測基因抑制效果。如果需要，細胞培養(yǎng)4-6h時可以更換培養(yǎng)基，但不是必須。孵育時間的長短，取決于細胞類型、
所干擾基因本身及分析方法�？稍O置不同的孵育時間進行實驗以確定最佳孵育時間。
轉(zhuǎn)染實驗優(yōu)化: 為了提高轉(zhuǎn)染效率，最好對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化，特別是首次使用。例如：24孔培養(yǎng)板，調(diào)整 siRNA與RFectPM試劑的用量。siRNA用量在0.6-30 pmol (final concentration 1- 50 nM)之間調(diào)整，RFectPM試劑用量在1.0 - 3.0μl之間調(diào)整。

原代細胞轉(zhuǎn)染實驗要點：
轉(zhuǎn)染過程不可添加抗生素，否則會導致細胞死亡；
首次實驗siRNA的用量設置在終濃度10nM、30nM、50nM、100 nM進行摸索 ，后續(xù)實驗根據(jù)實驗結(jié)果修改。

RFectPM可用來轉(zhuǎn)染siRNA、antisense RNA、microRNA等200bp以內(nèi)的小分子RNA和DNA，可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細胞。對于大多數(shù)原代細胞，RFectPM的細胞轉(zhuǎn)染陽性率都在80%以上，而轉(zhuǎn)染細胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡便，先將sRNA與RFectPM室溫混合，再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細胞，血清對轉(zhuǎn)染效果沒有影響，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液。

使用RFect 系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測實驗注意事項：
1.細胞接種：一般做轉(zhuǎn)染前一天接種/鋪板（細胞計數(shù)大約5*10^4cell/ml），使做轉(zhuǎn)染前細胞密度在30-50%；如果細胞是原代細胞，接種密度可以密一些，細胞計數(shù)在2*10^6cell/ml；懸浮細胞可以在轉(zhuǎn)染當天接種/鋪板（細胞計數(shù)大約5*10^4cell/ml），待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細胞密度30-40%。
2.為了能在使用時有較好的轉(zhuǎn)染效果，第一次使用建議您用24孔板做，每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將最佳轉(zhuǎn)染條件（siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例）放大到對應的孔板即可。
3.設置siRNA終濃度10nM,30nM,50nM,100nM四個梯度，每個梯度最好做2-3個復孔（至少2個復孔，避免實驗誤差）。
4.用來稀釋siRNA和稀釋轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基必須是無血清培養(yǎng)基，因為血清的存在會干擾siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合，并且影響轉(zhuǎn)染效率。
5.檢測方法：轉(zhuǎn)染后48h收細胞做qPCR基因水平檢測或者轉(zhuǎn)染后72h收細胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測。

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