如何提高PCR的擴(kuò)增特異性

      疫情當(dāng)下，最熱頻的詞匯莫過于核酸檢測(cè)了。而核酸檢測(cè)最核心的技術(shù)也越來越被大眾所熟知，就是我們高中就學(xué)過的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱為PCR。

 

       自從1983年，Kary Mullis才發(fā)明出這個(gè)用于擴(kuò)增目標(biāo)DNA的研究工具—PCR技術(shù)后，其逐漸成為分子生物學(xué)研究必不可少的一部分，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測(cè)和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。而Kary Mullis也因這一發(fā)明獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

 

       而熟悉PCR的同學(xué)們都知道，PCR之所以能夠在短時(shí)間內(nèi)將單個(gè)DNA分子擴(kuò)增數(shù)百萬倍以便于下游實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，主要依靠這三個(gè)步驟連續(xù)多次循環(huán)而實(shí)現(xiàn)：

 

      （1） DNA變性：首先對(duì)雙鏈DNA模板進(jìn)行高溫加熱，使DNA雙鏈變性解離成單鏈；

 

      （2） 引物退火：被稱為引物的短DNA分子與目標(biāo)DNA的側(cè)翼區(qū)域結(jié)合；

 

      （3） 延伸擴(kuò)增：DNA聚合酶沿著模板鏈將引物3’端進(jìn)行延伸。將這些步驟重復(fù)（“循環(huán)”）25-35次，即可按指數(shù)方式獲得精確的目標(biāo)DNA拷貝。

 

 

       而PCR這項(xiàng)核心技術(shù)的核心是強(qiáng)大的DNA聚合酶，其在新DNA鏈合成中扮演著重要的角色，是PCR反應(yīng)不可或缺的組成部分，是保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性、熱穩(wěn)定性、保真度等方便的重要因素。

 

       而對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過程中，延伸錯(cuò)配的非特異產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生是PCR實(shí)驗(yàn)中常遇到的問題，這些都與DNA聚合酶有關(guān)。因?yàn)檫@種非特異擴(kuò)增會(huì)顯著降低目的基因擴(kuò)增的產(chǎn)率和靈敏度，從而影響擴(kuò)增結(jié)果的合理解釋和下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的成功。

 

       那么，問題來了，如何減少非特異性擴(kuò)增？

 

       方案之一：在冰上配制PCR反應(yīng)，這是我們經(jīng)常的操作。因?yàn)檫@樣有助于將DNA聚合酶的活性保持在低水平。

 

       但在PCR開始之前，依然可能會(huì)合成不需要的產(chǎn)物。

 

       另一個(gè)辦法是將DNA聚合酶的加入時(shí)間推遲到第一個(gè)循環(huán)的退火步驟。因?yàn)橹挥性?0℃以上的初始變性步驟之后才能開始擴(kuò)增，所以該技術(shù)被稱為“熱啟動(dòng)”。所以后來為了避免非特異性擴(kuò)增，科學(xué)家們開始進(jìn)行手動(dòng)熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)，但是這個(gè)過程不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且會(huì)增加樣品污染和降低實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性的風(fēng)險(xiǎn)。
 

       后來，人們發(fā)明了具有熱啟動(dòng)特性的DNA聚合酶，既抗體修飾的DNA聚合酶。

 

       這種DNA聚合酶通過對(duì)酶活性位點(diǎn)抗體修飾，抑制其在室溫下的活性，在初始高溫變性步驟（如，>90℃）階段，結(jié)合的抗體失活，從而激活DNA聚合酶。

 

    

 

       由于DNA聚合酶在室溫下的活性被抑制，所以，熱啟動(dòng)技術(shù)為在室溫下配制多個(gè)PCR反應(yīng)體系提供了極大的便利，且不會(huì)影響特異性和擴(kuò)增能力

 

       而BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列PCR試劑盒既是基于抗體修飾法的qPCR定量檢測(cè)試劑盒。

 

       BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列試劑盒采用了新型抗體修飾的BlazeTaq™熱啟動(dòng)DNA聚合酶，室溫時(shí)酶的活性被抗體完全封閉，更有效地抑制非特異性擴(kuò)增；反應(yīng)時(shí)只需95°C預(yù)變性30 s即可使酶完全被激活，可明顯地縮短qPCR反應(yīng)時(shí)間。此外，優(yōu)化的Buffer體系顯著提高Real Time PCR反應(yīng)的靈敏度和重復(fù)性，同時(shí)具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)范圍廣的特點(diǎn)，并能有效抑制引物二聚體的產(chǎn)生，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

 

       本產(chǎn)品提供了一種通用的反應(yīng)條件及實(shí)驗(yàn)操作流程，且推出帶有、或不帶有ROX參比染料的兩個(gè)版本供用戶選擇，適用于大多數(shù)熒光定量 PCR 儀。

 

       產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

 

       靈敏度高：可檢測(cè)低至5個(gè)拷貝數(shù)的DNA模板

       特異性強(qiáng)：抗體修飾熱啟動(dòng)DNA聚合酶，更有效抑制引物二聚體以及非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生

       擴(kuò)增效率高：在寬廣的GC含量范圍內(nèi)能維持高擴(kuò)增效率

       操作簡(jiǎn)單：預(yù)先配好的5×預(yù)混液，反應(yīng)前只需加入模板、引物、滅菌水

       適用性廣：提供帶有或不帶有ROX的兩個(gè)版本可選，適用于大多數(shù)熒光定量PCR儀

 

   

     
        圖1. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0擴(kuò)增8個(gè)10倍梯度稀釋的雙鏈DNA片段，DNA拷貝數(shù)范圍為5×107~5個(gè)拷貝。如圖所示，試劑盒顯示出高靈敏度的特性，在寬廣的定量范圍內(nèi)具有優(yōu)異的線性相關(guān)性。

競(jìng)品產(chǎn)品性能對(duì)比：

 

 

 

       圖3. BlazeTaq™（紅色）與Powerup™ SYBR Green Master Mix（綠色）和Promega（藍(lán)色）GoTaq® QPCR Master Mix（綠色）的性能對(duì)比顯示，其靈敏度、擴(kuò)增效率和特異性更高。

 

 

       圖4. Ct值比較。 使用BlazeTaq™（藍(lán)色），Applied Biosystems的PowerUp™ SYBR Green Master Mix（橙色）和來自Promega的GoTaq® qPCR Master Mix（灰色）擴(kuò)增來自10 ng HeLa cDNA的41個(gè)基因。

 

 

       圖5.使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分別擴(kuò)增50個(gè)和5個(gè)拷貝數(shù)的同一個(gè)DNA模板，并設(shè)無模板對(duì)照（NTC組），每組qPCR反應(yīng)重復(fù)24次。結(jié)果顯示，試劑盒對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。cDNA的41個(gè)基因。

 

BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0擴(kuò)增

 

圖6. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分別擴(kuò)增不同GC含量（GC含量范圍在39.3~61.2%之間）的DNA模板。結(jié)果顯示，各模板的擴(kuò)增效率仍能維持在90%~110%之間，表明試劑盒對(duì)GC含量在一定范圍內(nèi)的DNA模板適用性廣。

 

產(chǎn)品名稱	描述	貨號(hào)	規(guī)格
BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix2.0	新型real-time PCR專用試劑，包含已優(yōu)化濃度的抗體修飾Hot-start DNA聚合酶、Buffer、dNTP、Mg2+和SYBR Green的混合試劑，以及ROX參比染料	QP031	20ul體系×200次qPCR反應(yīng)
		QP032	20ul體系×600次qPCR反應(yīng)
		QP033	20ul體系×1200次qPCR反應(yīng)
BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix2.0 (without ROX)	新型real-time PCR專用試劑，包含已優(yōu)化濃度的抗體修飾Hot-start DNA聚合酶、Buffer、dNTP、Mg2+和SYBR Green的混合試劑	QP041	20ul體系×200次qPCR反應(yīng)
		QP042	20ul體系×600次qPCR反應(yīng)
		QP043	20ul體系×1200次qPCR反應(yīng)

 

       艾美捷科技有限公司，通過提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶關(guān)系和供應(yīng)鏈管理，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。我們的企業(yè)的核心價(jià)值觀：“激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越”。激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競(jìng)爭(zhēng)力的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶創(chuàng)造最大價(jià)值是我們的企業(yè)使命。我們的企業(yè)愿景是成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。

 

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