新冠肺炎檢測診斷方法的差異分析

2019年冠狀病毒病（COVID-19）的大流行繼續(xù)影響著世界大部分地區(qū)。對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）診斷檢測的認(rèn)識仍在不斷發(fā)展，對各類檢測性質(zhì)的清楚認(rèn)識和對其結(jié)果的解讀十分重要。
 

▲詳見https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2765837

近日，《JAMA》發(fā)表了一篇觀點性文章，描述了如何解讀2種常用于SARS-CoV-2感染的診斷檢測——逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和IgM和IgG酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），以及其檢測結(jié)果如何隨時間變化。

 

▲SARS-CoV-2診斷檢測與COVID-19發(fā)生發(fā)展的動態(tài)關(guān)系

注
估計的時間間隔和病毒檢測率是基于一些已發(fā)表報告的數(shù)據(jù)。由于研究值的差異性，圖中估計的時間間隔應(yīng)被認(rèn)為是近似值，僅定性地給出了SARS-CoV-2感染的可能檢測概率。
a 只有在患者從暴露時開始主動隨訪的情況下，才會開展檢測。
b 鼻咽拭子的PCR結(jié)果更可能為陰性，而不是陽性。

病毒RNA的RT-PCR檢測
迄今為止，診斷COVID-19最常用和最可靠的檢測方法是基于鼻咽拭子或其他上呼吸道樣本（包括咽拭子或最近采用的唾液）的RT-PCR檢測。不同的制造商使用不同的RNA基因靶點，大多數(shù)檢測針對病毒包膜（env）、核衣殼（N）、刺突糖蛋白（S）、RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）和ORF1基因中的一個或多個。根據(jù)一些比較性研究，除了RdRp-SARSr (Charité)引物探針可能由于反向引物的不匹配而具有稍低的敏感性外，RT-PCR檢測對不同單個基因的敏感性是相當(dāng)?shù)摹?br />
在大多數(shù)有癥狀的SARS-CoV-2感染者中，鼻咽拭子中的病毒RNA在癥狀出現(xiàn)的第1天就可以檢測到，并在癥狀出現(xiàn)的第1周內(nèi)達(dá)到高峰。RT-PCR的循環(huán)閾值（Ct）指產(chǎn)生熒光信號所需的復(fù)制周期數(shù)，較低的Ct值代表較高的病毒RNA載量。臨床報告Ct值小于40為PCR陽性。RT-PCR檢測的陽性率在第3周開始下降，隨后變得不可檢測。

然而，重癥住院COVID-19患者的Ct值低于輕癥患者的Ct值，并且可能在發(fā)病3周后仍持續(xù)表現(xiàn)為PCR檢測陽性，而大多數(shù)輕癥患者則呈陰性結(jié)果。值得注意的是，PCR結(jié)果呈“陽性”僅反映檢測到病毒RNA，并不一定表示存在活病毒。
在某些情況下，即使在第一次檢測呈陽性的6周之后，仍可通過RT-PCR檢測到病毒RNA。少數(shù)病例在24小時連續(xù)兩次PCR檢測呈陰性后也轉(zhuǎn)為呈陽性。尚不清楚這是否是檢測錯誤、再次感染或再次激活。

▶ 在一項對9名COVID-19患者的研究中，在發(fā)病的第8天之后，研究人員未能從培養(yǎng)基中分離病毒，這與發(fā)病第1周之后病毒感染性的下降有關(guān)。

這就是為什么美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）就“醫(yī)護(hù)人員何時可以重回工作崗位”提出了“基于癥狀的策略”建議：
“在恢復(fù)后至少3天（72小時）達(dá)到未使用退燒藥的真正退燒；并且呼吸系統(tǒng)癥狀（如咳嗽、呼吸急促）得到改善；并且自首次癥狀出現(xiàn)至少已過去10天。”

其他樣本的PCR陽性時間線與鼻咽拭子不太相同。

▶ 在一項研究中，96名受感染者中有55名（57%）的糞便樣本檢測出PCR陽性，而在鼻咽拭子呈陰性后，在4-11天的中位數(shù)期間其糞便PCR仍保持陽性，但與臨床嚴(yán)重程度無關(guān)。

▶ 有研究發(fā)現(xiàn)，痰和糞便中PCR陽性持續(xù)時間相似。痰中PCR陽性率下降較慢，在鼻咽拭子陰性后仍可能為陽性。

▶ 另一項研究發(fā)現(xiàn)，在205例確診為COVID-19的患者中，RT-PCR陽性率最高的是支氣管肺泡灌洗標(biāo)本（93%），其次是痰（72%）、鼻拭子（63%）、咽拭子（32%）。

假陰性結(jié)果主要是由于與發(fā)病有關(guān)的采樣時機不當(dāng)和采樣技術(shù)不當(dāng)，尤其是鼻咽拭子。大多數(shù)RT-PCR檢測的特異性為100%，這是因為引物設(shè)計對SARS-CoV-2的基因組序列具有特異性。由于技術(shù)錯誤和試劑污染，偶爾會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

SARS-CoV-2的抗體檢測
SARS-CoV-2感染也可以通過檢測宿主對SARS-CoV-2感染的免疫反應(yīng)被間接檢測到。血清學(xué)診斷對于輕到中度COVID-19患者尤其重要，這些患者可能在發(fā)病兩周之后可被檢出。血清學(xué)診斷也正在成為了解社區(qū)中COVID-19傳播范圍和識別潛在“已獲得免疫通行證”個體的重要工具。

最敏感和最早的血清學(xué)標(biāo)志物是總抗體，其水平從癥狀出現(xiàn)的第2周開始升高。雖然IgM和IgG-ELISA早在癥狀出現(xiàn)的第4天就被發(fā)現(xiàn)呈陽性，但在疾病的第2周和第3周才呈較高水平。

▶ 例如，根據(jù)兩項分別對23名COVID-19患者和85名患者的檢測，所有患者在臨床發(fā)病的第3周和第4周之間都發(fā)生了IgM和IgG血清轉(zhuǎn)化。此后，IgM開始下降，到第5周達(dá)到較低水平，到第7周幾乎消失；而IgG持續(xù)超過7周。

▶ 在一項140例患者的研究中，PCR和IgM-ELISA聯(lián)合檢測核衣殼（NC）抗原的敏感性達(dá)到98.6%，而單獨PCR檢測僅51.9%。在發(fā)病的最初5.5天，定量PCR的陽性率高于IgM，而IgM-ELISA在發(fā)病的第5.5天后的陽性率更高。

基于ELISA的IgM和IgG抗體檢測對COVID-19的診斷具有95%以上的特異性。首次PCR檢測和2周后進(jìn)行配對血清樣本檢測，可進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn)確率。

通常，大多數(shù)抗體都是針對SARS-CoV-2中最豐富的核衣殼蛋白（NC）。因此，針對NC抗體的檢測將是最敏感的。然而，S蛋白的受體結(jié)合域（RBD-S）是宿主附著蛋白，抗RBD-S的抗體將更具特異性，有望成為中和抗體。因此，用上述一種或兩種抗原檢測IgG和IgM具有較高的敏感性。不過，抗體可能與非典冠狀病毒（SARS-CoV）和其他冠狀病毒有交叉反應(yīng)。

抗體的即時/床邊快速檢測已經(jīng)得到廣泛的商業(yè)化開發(fā)，但質(zhì)量參差不齊。許多制造商沒有透露所用抗原的性質(zhì)。這些檢測本質(zhì)上是純定性的，只能表明是否存在SARS-CoV-2抗體。

中和抗體的存在只能通過菌斑減少中和測試來證實。不過，ELISA檢測到的IgG抗體的高滴度被發(fā)現(xiàn)與中和抗體呈正相關(guān)。中和抗體的長期持久性和保護(hù)期尚不清楚。

展望
研究利用現(xiàn)有證據(jù)，設(shè)計了檢測COVID-19的診斷標(biāo)記物的臨床時間線。大多數(shù)可獲得的數(shù)據(jù)是針對沒有免疫受損的成年人群的。PCR陽性和血清轉(zhuǎn)化的時間進(jìn)程在兒童和其他人群中可能有所不同，包括大量無癥狀個體在沒有積極監(jiān)測的情況下未被診斷。
許多疑問仍待解決，特別是在感染SARS-CoV-2的無癥狀和有癥狀的個體中，潛在免疫力能持續(xù)多久？

先達(dá)基因成功完成ERA法新型冠狀病毒快速檢測試劑盒開發(fā)
應(yīng)對疫情，蘇州先達(dá)基因科技有限公司迅速反應(yīng)、正面抗擊！目前已成功研制出新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，通過實驗檢測，可在反應(yīng)20分鐘內(nèi)得出結(jié)果，8~15分鐘即可對1000到100拷貝數(shù)的病毒基因給出結(jié)果判斷。

樣品檢測結(jié)果：

 

圖1：先達(dá)基因GS8熒光檢測儀檢測結(jié)果

 

表1：先達(dá)基因GS8儀器檢測結(jié)果分析

 
蘇州先達(dá)基因是一家致力分子檢測與診斷領(lǐng)域核酸快速檢測產(chǎn)品研發(fā)的企業(yè)，公司研發(fā)的低溫快速核酸檢測技術(shù)（ERA技術(shù)），它具有低溫適應(yīng)性，而且在反應(yīng)速度、靈敏度、準(zhǔn)確性等方面有了極大的突破。該技術(shù)在低溫條件下（25-42℃）可對極微量的病原體的基因片段進(jìn)行特異性的快速擴增，10-15分鐘可將目標(biāo)基因片段精準(zhǔn)復(fù)制數(shù)十億倍，只需20 min，就能完成現(xiàn)場檢測并出具報告，極大縮短了檢測時間。

由于時間緊迫，先達(dá)基因“新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（RT-ERA熒光檢測法）”，目前僅為科研類產(chǎn)品。先達(dá)基因科技有限公司愿與有擔(dān)當(dāng)?shù)钠髽I(yè)或科研院所一起向藥品監(jiān)督管理部門提出醫(yī)療器械應(yīng)急審批申請，并將產(chǎn)品提供給各級疾控部門和醫(yī)療機構(gòu)檢測使用，幫助政府和衛(wèi)生部門防控篩查潛在新型冠狀病毒感染患者，控制疾病傳播。