PCR疑難問題解答第二篇：熒光定量PCR

      【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機（一）——終點PCR

 

       實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴增反應(yīng)中的每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現(xiàn)對起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過兩種方式——熒光染料或者熒光標(biāo)記的探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

 

    熒光定量PCR，qPCR

 

       熒光染料法

 

       在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，該染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，并不與單鏈DNA鏈結(jié)合，而且在游離狀態(tài)不發(fā)出熒光，只有摻入DNA雙鏈中才可以發(fā)光，因此，在PCR體系中，隨著特異性PCR產(chǎn)物的指數(shù)擴增，每個循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。

 

       武漢艾美捷科技專注為客戶提供整體打包方案，可提供EvaGreen、SolisGreen和SYBR等多種染料qPCR預(yù)混液。

 

 

       EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料

 

       熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在最常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen屬于飽和熒光染料。非飽和熒光染料在濃度高的時候會對PCR過程產(chǎn)生抑制，所以在熒光定量實驗時使用濃度稍低，染料不能占據(jù)DNA雙鏈上的所有位置。當(dāng)PCR隨著溫度上升，雙鏈逐漸解鏈，染料會從已解開的單鏈上脫落，然后結(jié)合到臨近的尚未解鏈的雙鏈中去繼續(xù)發(fā)熒光。這種染料重排導(dǎo)致在較小的溫度變化內(nèi)，雖然DNA雙鏈的解鏈過程不同，但熒光值是幾乎不變的，也就是說，其溶解曲線不能精確反應(yīng)雙鏈的解鏈情況。

 

       所以，對于非飽和染料，其溶解曲線分辨率相對較低，只能區(qū)分特異性的產(chǎn)物，不能分辨單堿基的差異。飽和熒光染料在DNA雙鏈中所有可結(jié)合位點內(nèi)都會有染料分子存在，染料與DNA的結(jié)合呈飽和狀態(tài)，隨著溫度上升，在雙鏈解鏈、染料脫離過程中，未解鏈的雙鏈部分不存在染料可以結(jié)合的位點，染料不能發(fā)生重排。所以使用飽和染料制作的溶解曲線分辨率很高，可以精確反映DNA雙鏈隨著溫度的解鏈情況，精度可以達(dá)到單堿差異的區(qū)分。

 

       熒光標(biāo)記的探針法

 

       PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團， 探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR擴增時（在延伸階段），Taq 酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。

 

 

       染料法VS探針法

 

       1.探針法通過探針可以增加反應(yīng)收集信號的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴增才能收集到信號，探針法能夠用多重體系反應(yīng)，能夠預(yù)測和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，缺點是要合成探針，成本高

 

       2.染料法經(jīng)濟實惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的TM值，缺點就是特異性沒有探針法好

 

 

 

類型		貨號	名稱
染料法	EvaGreen染料	08-36-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix 5×qPCR 預(yù)混液
		08-24-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX) 5×qPCR預(yù)混液,ROX
		08-25-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (no ROX) 5×qPCR預(yù)混液,無ROX
		08-26-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) 5×qPCR預(yù)混液,Capillary
	SolisGreen染料	28-41-00001	SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (no ROX)  5×qPCR預(yù)混液,ROX
		28-46-00001	SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (ROX) 5×qPCR預(yù)混液,無ROX
	SYBR染料	QP031	qPCR預(yù)混液2.0,ROX
		QP041	qPCR預(yù)混液2.0,無ROX
探針法	08-17-00001		5×HOT FIREPol ® Probe Universal qPCR Mix
	QP036		5×探針qPCR預(yù)混液,ROX
	QP046		5×探針qPCR預(yù)混液,無ROX
	08-16-00001		5×HOT FIREPol® Probe qPCR Mix Plus (Capillary)
	多重qPCR	08-01-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix 5x多重探針qPCR預(yù)混液
		08-02-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Rox) 5x多重探針qPCR預(yù)混液,Rox
		08-03-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Purple) 5x多重探針qPCR 預(yù)混液,Purple
	快速qPCR	28-21-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (no ROX) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,無ROX
		28-22-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (ROX) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,ROX
		28-23-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (Purple) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,Purple
在線客服	雷雷		閃閃

    qPCR系統(tǒng)知識匯總

 

       在qPCR 技術(shù)中重要的參數(shù)指標(biāo)有哪些？

 

       擴增及溶解曲線：擴增曲線是PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光強度為縱坐標(biāo)所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態(tài)進(jìn)程；溶解曲線是用來驗證擴增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會出現(xiàn)單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現(xiàn)至少兩個峰。

 

       熒光域值（threshold）: 是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。

 

       Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在線性關(guān)系，可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。

 

 

       擴增曲線一般分為哪幾個階段

 

       熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。在qPCR擴增早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化，此時即為基線期，

 

       PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入平臺期，在該時期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系，只有在熒光信號的指數(shù)增長期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。

 

 

       ROX染料是什么作用？

 

       ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應(yīng)中能被qPCR儀檢測到。ROX不參與qPCR反應(yīng)，熒光信號值不會隨著qPCR擴增而改變。實驗過程中很多因素會引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學(xué)因素（液滴、氣泡）的因素，反應(yīng)體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽性參比，對其他熒光信號進(jìn)行歸一化校正，以提高數(shù)據(jù)的精確度。

 

       Ct值多少才算理想

 

       一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結(jié)果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴增，但也不是絕對的，需要輔以溶解曲線加以解釋。

 

    *** qPCR 常見問題分析 ***

 

問題類型	原因分析
無Ct值出現(xiàn)	* 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號； * 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性； * 模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起； * 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況
Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct>38）	* 擴增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，設(shè)計更好的引物或探針、適當(dāng)降低退火溫度、增加鎂離子濃度等； * PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不足； * PCR產(chǎn)物太長：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳	* 加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度； * 標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品 * 引物或探針不佳：重新設(shè)計更好的引物和探針； * 模板中存在抑制物，或模板濃度過高
擴增曲線異常，比如 S 型曲線	* 參比染料設(shè)定不正確：預(yù)混液不加參比染料時，選NONE； * 模板的濃度太高或者降解； * 熒光染料的降解
負(fù)對照有信號、溶解曲線不止一個主峰	* 引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn) * 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比 * 鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒；
擴增效率低	* 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解； * 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度； * 反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響

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