多肽FRET熒光標(biāo)記技術(shù)

熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí)，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)指利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息。熒光標(biāo)記的無(wú)放射物污染，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。人們利用熒光標(biāo)記的多肽來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開(kāi)發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。肽谷生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期開(kāi)發(fā)，能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是一種非輻射能量躍遷，通過(guò)分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過(guò)程。此過(guò)程沒(méi)有光子的參與，所以是非輻射的。該分析方法具有快速、敏感和簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

用于FRET試驗(yàn)的染料是可以相同的。但在大多數(shù)應(yīng)用中其實(shí)是使用不同的染料。例如，一個(gè)供體基團(tuán)（EDANS）和接受基因（DABCYL）勻被連接到一HIV蛋白酶的天然底物上，當(dāng)該底物未被切斷時(shí)，DABCYL可淬滅EDANS，從而檢測(cè)不到熒光。當(dāng)該底物被HIV-1蛋白酶切斷后，EDANS不再被DABCYL淬滅，隨即可檢測(cè)到EDANS熒光。蛋白酶抑制劑的有效性可憑借EDANS熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應(yīng)過(guò)程可被連續(xù)監(jiān)測(cè)，為酶活性的檢測(cè)提供了一個(gè)便捷的方法。供體/受體對(duì)的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級(jí)濃度的酶活性。當(dāng)FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝滅，但當(dāng)供體/受體對(duì)的任何肽鍵斷裂就會(huì)釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測(cè)，從而可對(duì)酶的活性進(jìn)行定量分析。FRET 肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動(dòng)力特征和功能特征；對(duì)新的蛋白水解酶的篩選和檢測(cè)；對(duì)多肽折疊的構(gòu)象研究等。

常用FRET的標(biāo)準(zhǔn)染料組合

Fluorescein and Dabcyl:	FAM/Lys(Dabcyl)
Fluorescein and Tamra:	FAM/TAMRA
Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP):	MCA/Lys(Dnp).
Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) Abz/Tyr (NO2) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp):	Abz/Tyr (NO2) Abz/EDDnp
Dabcyl and Glu(EDANS)：	Dabcyl/Glu(EDANS)

FRET共振能量轉(zhuǎn)移引發(fā)熒光猝滅的激發(fā)與發(fā)射波

猝滅劑	熒光團(tuán)	激發(fā)波(nm)	發(fā)射波(nm)
Dabcyl	Edans	336	490
Dansyl	Trp	336	350
DNP	Trp	328	350
DNP	MCA	328	393
DNP	Abz	328	420
Tyr (NO2)	Abz	320	420

常規(guī)RET供體(Donor)-接受(Aceptor)對(duì)的福斯特臨界距離(Forster Critical Distance)

供體(Donor)	接受(Aceptor)	福斯特臨界距離(nm)
Tryptophan	Dansyl	2.1
IAEDANS (1)	DDPM (2)	2.5-2.9
BFP	DsRFP	3.1-3.3
Dansyl	FITC	3.3-4.1
Dansyl	Octadecylrhodamine	4.3
CFP	GFP	4.7-4.9
CF (3)	Texas Red	5.1
Fluorescein	Tetramethylrhodamine	4.9-5.5
Cy3	Cy5	5.0
GFP	YFP	5.5-5.7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5.7
Rhodamine 6G	Malachite Green	6.1
FITC	Eosin Thiosemicarbazide	6.1-6.4
B-Phycoerythrin	Cy5	7.2
Cy5	Cy5.5	>8.0

      (1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
      (2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
      (3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
      (4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene