10x系列應(yīng)用之超高通量和單細(xì)胞多組學(xué)

玩轉(zhuǎn)10x之一：
scifi-RNA-seq 借助ATAC試劑盒實(shí)現(xiàn)
超高通量單細(xì)胞表達(dá)譜測(cè)序ifi-RNA

       奧地利科學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究中心 (CeMM) 的研究人員開發(fā)了一種新的單細(xì)胞樣品制備方法，single-cell combinatorial fluidic indexing (Scifi)，可將基于10x Chromium Controller平臺(tái)單細(xì)胞RNA-seq的細(xì)胞通量提高15倍，這一成果發(fā)表在5月31日出版的Nature Methods上。
       在常規(guī)基于微滴的 scRNA-seq 中，進(jìn)入到同一微滴中的兩個(gè)細(xì)胞將使用相同的細(xì)胞標(biāo)簽標(biāo)記它們的轉(zhuǎn)錄組，在數(shù)據(jù)分析過程中，這兩個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將無法區(qū)分，從而產(chǎn)生了有偏差的結(jié)果。為了最大限度地減少雙細(xì)胞微滴的比例，需控制上樣細(xì)胞數(shù)，使得兩個(gè)細(xì)胞不太可能進(jìn)入同一個(gè)油包水微滴，大部分的微滴中僅含有Gel bead而不包含細(xì)胞。
       為提高油包水微滴的使用效率、釋放其高通量分析的全部潛力，作者在scifi-RNA-seq方法中，首先透化處理細(xì)胞或細(xì)胞核，將它們的轉(zhuǎn)錄組通過split pools方法在384孔板里反轉(zhuǎn)錄，加上預(yù)索引標(biāo)簽，隨后包含預(yù)索引標(biāo)簽cDNA的細(xì)胞或細(xì)胞核被匯集起來，10x上機(jī)制備油包水，生成的大多數(shù)微滴包有多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞核。應(yīng)用10x scATAC Gel bead kit，在油包水內(nèi)部cDNA又被標(biāo)上10x cell barcode。雖然這兩輪加的標(biāo)簽都不是單個(gè)細(xì)胞獨(dú)有的，而是相應(yīng)獨(dú)立反應(yīng)體系中的所有細(xì)胞共享的，但細(xì)胞或細(xì)胞核在兩輪標(biāo)簽之間隨機(jī)混合，兩種標(biāo)簽的組合能夠唯一地識(shí)別單個(gè)細(xì)胞。

•  經(jīng)透化處理的細(xì)胞或細(xì)胞核微孔板里進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并加上孔位特異性的第一輪標(biāo)簽

• 細(xì)胞帶著加標(biāo)簽的cDNA進(jìn)行10x上機(jī)，每個(gè)油包水里有1個(gè)Gel bead和多個(gè)細(xì)胞

• 細(xì)胞在油包水中裂解

• cDNA通過等溫連接加上第二輪即Gel bead上的10x barcode標(biāo)簽

• 通過識(shí)別兩輪標(biāo)簽組合拆分單細(xì)胞數(shù)據(jù)

       scifi 方法在概念上不同于cell hashing，cell hashing標(biāo)簽區(qū)別的是各個(gè)樣品，而scifi基于全轉(zhuǎn)錄組預(yù)索引標(biāo)簽，可以將轉(zhuǎn)錄本從超量上樣的油包水中溯源為各自的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。另外，scifi在可操作性上優(yōu)于傳統(tǒng)的多輪組合標(biāo)簽的方法，多輪組合標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)流程繁瑣，且每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性較低。Scifi將微孔板和微流控組合，在 Chromium Controller系統(tǒng)的每個(gè)通道可獲得多達(dá) 150,000個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，每張芯片100 萬個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，且每個(gè)細(xì)胞能夠獲得高復(fù)雜性的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。作者用多種細(xì)胞系以及原代細(xì)胞進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。作者推測(cè)scifi-RNA-seq 最可能立即用于兩個(gè)領(lǐng)域：追求復(fù)雜組織、器官或整個(gè)生物體的單細(xì)胞表征的細(xì)胞圖譜項(xiàng)目，以及高通量擾動(dòng)研究，包括藥物篩選和單細(xì)胞 CRISPR 篩選。

滴~EMTD溫馨提示

       目前此方法仍處于學(xué)術(shù)研究、實(shí)驗(yàn)室研發(fā)范疇，未達(dá)到經(jīng)反復(fù)檢驗(yàn)的商業(yè)化應(yīng)用階段。10x 目前已推出超高通量的Chromium X及試劑 ，結(jié)合CellPlex 試劑盒，單張芯片通量可達(dá)到百萬細(xì)胞級(jí)別。
 

玩轉(zhuǎn)10x之二：
ASAP-seq, Dogma-seq單細(xì)胞DNA/RNA/Protein
中心法則三要素一網(wǎng)打盡

       美國紐約基因組中心的研究人員開發(fā)了兩種單細(xì)胞多組學(xué)檢測(cè)方法，一種是借助10x scATAC試劑盒，在單細(xì)胞水平同時(shí)檢測(cè)染色質(zhì)可及性、蛋白水平和線粒體DNA，命名為ASAP-seq (ATAC with select antigen profiling)。在文章的審稿過程中，10x推出了GEX+ATAC的單細(xì)胞多組學(xué)試劑盒，作者在此基礎(chǔ)上又開發(fā)了一種新方法Dogma-seq，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞同時(shí)檢測(cè)染色質(zhì)可及性、mRNA表達(dá)、蛋白水平和線粒體DNA克隆追蹤四重信息。這一成果發(fā)表在6月3日出版的Nature Biotechnology上。
       常規(guī)做ATAC-seq通常要盡量減少線粒體DNA的干擾，但作者認(rèn)為如果能夠富集獲得高覆蓋度的線粒體信息，就可以通過線粒體基因組攜帶的突變進(jìn)行追蹤，以研究細(xì)胞間的相互關(guān)系。作者又基于CITE-seq技術(shù)還開發(fā)了一套bridge oligos，使得帶oligo標(biāo)簽的抗體檢測(cè)可以整合到ATAC-seq的流程中。

       上圖詳解了ASAP-seq如何將蛋白檢測(cè)整合進(jìn)scATAC-seq的工作流程。a.細(xì)胞樣品前處理用連有oligo的抗體染色，而后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、透化處理、Tn5酶專座。b.在油包水微滴內(nèi)，抗體標(biāo)簽結(jié)合外加的bridge oligos并以其為模板延伸，延伸后可以同Gel beads上的oligo互補(bǔ)，后續(xù)抗體標(biāo)簽和ATAC酶切下來的DNA片段均被加上細(xì)胞Barcode。
      作者進(jìn)一步將蛋白檢測(cè)推進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)蛋白水平，ASAP-seq的細(xì)胞固定后透化處理步驟有可能用于檢測(cè)胞內(nèi)蛋白，而這在高通量的scRNA-seq中是無法做到的。作者用不同接頭的抗體標(biāo)簽以區(qū)別胞內(nèi)和細(xì)胞表面蛋白，用細(xì)胞表面蛋白TSA TBNK panel和3種TSB胞內(nèi)蛋白抗體染色PBMC，在根據(jù)單細(xì)胞ATACT結(jié)果分群的圖中，蛋白marker的分布與先驗(yàn)知識(shí)以及基因活性值是一致的。

       上圖展示了ASAP-seq檢測(cè)細(xì)胞表面及胞內(nèi)蛋白的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果。a.PBMC先染細(xì)胞表面的TSA TBNK Panel，進(jìn)行細(xì)胞固定和透化，而后染TSB胞內(nèi)的蛋白。b.PBMC根據(jù)ATAC結(jié)果分群，將主要的外周血細(xì)胞類型進(jìn)行了注釋。c和d分別顯示了細(xì)胞表面和胞內(nèi)蛋白細(xì)胞分布。         Dogma-seq借助10x的多組學(xué)試劑，蛋白檢測(cè)應(yīng)用帶Poly A的Total-seq A抗體標(biāo)簽，可以和多組學(xué)Gel bead上的oligo T互補(bǔ)。作者測(cè)試了LLL和DIG不同的細(xì)胞透化方法，LLL是指使用0.1% PFA / 0.1% NP40，DIG方法為使用0.01% Digitonin，結(jié)果顯示LLL可得到更多更完整的線粒體DNA信息用于追蹤，而DIG方法可以更好地檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白。