非洲豬瘟病毒核酸提取操作中需要關(guān)注的細(xì)節(jié)

非洲豬瘟 (African swine fever, ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (ASF virus, ASFV) 引起的一種嚴(yán)重的動(dòng)物傳染病，非洲豬瘟強(qiáng)毒感染豬的發(fā)病率和死亡率高達(dá) 100 %。在世界范圍內(nèi)，目前還沒(méi)有研發(fā)出可以有效預(yù)防非洲豬瘟的疫苗，非洲豬瘟可防、可控、不可治，所以做好養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全防護(hù)和通過(guò)檢測(cè)及監(jiān)測(cè)病毒做到“精準(zhǔn)拔牙”是防控非洲豬瘟。

非洲豬瘟病毒簡(jiǎn)介：
非洲豬瘟病毒屬于一類特殊的DNA病毒-核質(zhì)大DNA病毒（nucleocytoplasmic large DNA virus ，NCLDV)。整個(gè)病毒的直徑達(dá)到260-300nm, 相當(dāng)于730個(gè)甲肝病毒，140個(gè)ZIKA病毒，10個(gè)HSV皰疹病毒。
 
非洲豬瘟主要經(jīng)過(guò)口或鼻腔直接接觸，或由于接觸污染的媒介物（受感染豬的組織、血液、排泄物和分泌物）而發(fā)病。病毒通過(guò)涉及動(dòng)力蛋白和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用的復(fù)雜過(guò)程進(jìn)入宿主細(xì)胞。病毒感染機(jī)體后，病毒感染途徑從豬的扁桃體和下頜淋巴結(jié)中的單核巨噬細(xì)胞開(kāi)始，隨著淋巴液和血液進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)毛細(xì)血管、動(dòng)脈、靜脈和淋巴結(jié)的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行侵襲，導(dǎo)致相應(yīng)組織、器官出現(xiàn)出血、漿液性滲出、血栓和梗死等病理變化，繼而造成全身性的出血病變。
 
非洲豬瘟病毒核酸提取純化:
由于非瘟病毒傳播能力強(qiáng)、致病率高、致死率強(qiáng)、病毒復(fù)制能力強(qiáng)且很難根除等特點(diǎn)，建議各大有條件的豬場(chǎng)（具備企業(yè)自己的實(shí)驗(yàn)室）保持一定的ASFV病毒檢測(cè)能力。雖然定期檢測(cè)會(huì)花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，但如果檢測(cè)出病毒，通常處于早期階段，避免更大的損失。病毒檢測(cè)基于不同的原理的方法很多，其中操作簡(jiǎn)便、靈敏度高且應(yīng)用較廣的的方法即非瘟病毒核酸提取搭配下游熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，而核酸提取又以操作簡(jiǎn)便、通量高、節(jié)省人力的磁珠法自動(dòng)化提取為主。成功的核酸提取的決定因素有三個(gè)，分別是前處理、試劑和操作流程。

1. 樣本類型及前處理
‍01 血拭子及全血
在病毒排毒階段，血液中的病毒含量較高，靜脈采血應(yīng)激大且有滴漏發(fā)生病毒擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，所以尾尖拭子采血操作簡(jiǎn)便，應(yīng)激小，污染風(fēng)險(xiǎn)低。血拭子作為核酸提取樣本類似稀釋后的全血樣本，由于采樣困難，并且血液存在病毒滯后問(wèn)題，所以血液樣本一般不適合早期“拔牙”監(jiān)測(cè)。血液樣本可以直接進(jìn)行提取操作，如樣本有凝血結(jié)塊，可短暫靜置或離心，取上清進(jìn)行核酸提取操作。

02 口鼻拭子
非瘟野毒排毒過(guò)程中，口鼻液比血液檢出病毒稍早。豬場(chǎng)在野毒“拔牙”中會(huì)經(jīng)常使用口鼻拭子進(jìn)行病毒檢測(cè)。

口鼻拭子作為核酸提取樣本可能會(huì)帶有豬源細(xì)胞， 所以下游病毒擴(kuò)增試劑盒可以采用內(nèi)源性內(nèi)參非瘟擴(kuò)增試劑盒，可以監(jiān)測(cè)病毒核酸提取步驟。除此之外，樣本也會(huì)混有豬口鼻附近的飼料、泥土、糞便等，如果含有此類抑制物較多可能會(huì)對(duì)核酸提取和擴(kuò)增造成不同程度的影響�？诒鞘米涌梢灾苯舆M(jìn)行提取操作，如含雜質(zhì)過(guò)多可短暫靜置或離心，取上清進(jìn)行核酸提取操作。

03 咽拭子
變異的非瘟毒株，在口鼻液中檢出率會(huì)較低，而此時(shí)咽部的扁桃體病毒含量較多，類似于人類采集新冠樣本一樣，從咽部采樣有利于檢出病毒。

咽拭子作為核酸提取樣本與口鼻拭子樣本類似。

04 口腔液
豬口腔液也就是豬唾液，一般采用咬繩或者唾液收集包等方法對(duì)豬唾液進(jìn)行收集。

唾液樣本中不僅含有多種酶，而且也會(huì)混有泥土、糞便、嘔吐物等含抑制物較多的成分，所以從豬唾液樣本中提取病毒核酸對(duì)核酸的提取效率和純度要求很高，豬唾液可以直接進(jìn)行提取操作，如含雜質(zhì)過(guò)多可短暫靜置或離心，取上清作為核酸提取的樣本。

05 環(huán)境樣本
非瘟病毒對(duì)溫度、_PH和腐敗抵抗力較強(qiáng)。除了從豬身上采集樣本外，也需要從豬場(chǎng)和人員流動(dòng)較大的場(chǎng)所進(jìn)行環(huán)境采樣，檢測(cè)環(huán)境樣本可以有效的監(jiān)測(cè)豬場(chǎng)病毒感染情況，一般采用生理鹽水紗布或者生理鹽水拭子對(duì)豬舍、門口、生活區(qū)、緩沖區(qū)、車輛、人員等位置進(jìn)行采樣檢測(cè)。環(huán)境樣本經(jīng)常被作為日常病毒檢測(cè)，也是豬場(chǎng)復(fù)產(chǎn)所必需做的病原檢測(cè)。

環(huán)境樣本種類復(fù)雜多樣，較臟的環(huán)境紗布樣本會(huì)比拭子樣本含有更多的抑制物，采集到的樣本會(huì)含有糞便、泥土、飼料、灰塵等一系列含腐殖酸的成分，所以比較臟的環(huán)境樣本對(duì)核酸提取試劑的要求也比較高。環(huán)境樣本可以直接進(jìn)行提取操作，如含雜質(zhì)過(guò)多可短暫靜置或離心，取上清進(jìn)行核酸提取操作。

06 組織樣本
研究表明，豬感染非瘟病毒后，體內(nèi)器官感染順序依次是脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)等，隨著時(shí)間推移，不同組織中檢出的效果便不再有差異。

組織樣本作為核酸提取樣本，一般需要用剪刀剪下1-2個(gè)黃豆粒大小組織，用2ml左右生理鹽水進(jìn)行組織研磨，研磨結(jié)束后取離心后上清進(jìn)行病毒核酸提取及檢測(cè)。

07 其他樣本
糞便、精液、去勢(shì)液等其他樣本。由于糞便樣本在經(jīng)過(guò)腸胃的消化后病毒含量較低，精液等樣本采集困難，所以此類樣本也較少應(yīng)用。

對(duì)于此類樣本的核酸提取難度也較大，糞便中腐殖酸等抑制物含量很高，提取后核酸易抑制下游擴(kuò)增；普通裂解液對(duì)裂解精液細(xì)胞釋放核酸較困難，一般會(huì)用DTT作為樣本前處理步驟。

2. 試劑
磁珠法提取核酸的方法是以超順磁性的納米磁性粒子為基質(zhì)，這種磁性粒子在高濃度離液劑的條件下可通過(guò)氫鍵和靜電特異的吸附核酸，而蛋白質(zhì)或其它非特異吸附的少量雜質(zhì)經(jīng)洗滌被去除，最后用低鹽緩沖液或RNase Free ddH₂O洗脫核酸。純化的核酸可適用于各種常規(guī)操作，包括熒光定量PCR、NGS相關(guān)的各種下游分子實(shí)驗(yàn)。

此方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

• 安全無(wú)毒，不使用傳統(tǒng)方法中的酚/氯仿等有毒試劑；
• 操作簡(jiǎn)單，提供預(yù)分裝試劑，無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間接觸實(shí)驗(yàn)試劑，整合流程自動(dòng)化；
• 高通量提取，同時(shí)批量處理8/16/32/48/64/96個(gè)樣本；
• 滿足微量生物樣本核酸提取的要求。

  一般磁珠法核酸提取中的磁珠是硅羥基基團(tuán)包被或者羧基基團(tuán)包被的磁珠。其表面包被的基團(tuán)可以在鹽橋作用下與核酸特異性結(jié)合。磁珠生產(chǎn)工藝不同會(huì)造成磁珠大小、磁珠形態(tài)、磁響應(yīng)、基團(tuán)包被量等效果不一，此外，相同的磁珠在不同的試劑體系下結(jié)果也會(huì)千差萬(wàn)別。鑒于豬場(chǎng)樣本種類極其復(fù)雜多樣，因此，我們建議在相同樣本及試劑體系下，對(duì)不同磁珠進(jìn)行測(cè)試，篩選出性能更好的磁珠。下表數(shù)據(jù)舉例說(shuō)明不同磁珠對(duì)于樣本兼容性效果不同，從表1數(shù)據(jù)可以明顯看出相較于其他磁珠，磁珠H的提取效率和樣本兼容性均較好。
 

表1 不同樣本背景稀釋的非瘟質(zhì)控品使用不同磁珠提取效果比較

3. 操作
01 裂解步驟
磁珠法核酸提取過(guò)程中的裂解和結(jié)合步驟可以分開(kāi)也可以合并，主要區(qū)別是磁珠在哪個(gè)步驟開(kāi)始參與核酸提取。一般會(huì)選擇裂解結(jié)合兩步驟共同進(jìn)行，可以將磁珠與核酸結(jié)合步驟做到作用最大化。

裂解步驟中裂解液一般會(huì)含有較高濃度的離液鹽和表面活性劑，不僅為磁珠與核酸結(jié)合提供高鹽環(huán)境，而且可以將核酸從細(xì)胞中裂解釋放出來(lái)。

而裂解步驟需不需要加蛋白酶K，一般跟樣本類型有關(guān)，血液類樣本由于含有較多蛋白及細(xì)胞成分，輔助加入蛋白酶K會(huì)促進(jìn)核酸從核酸蛋白復(fù)合體中釋放。而背景干凈的環(huán)境樣本，由于裂解液對(duì)于核酸的釋放作用已足夠，所以是否加入蛋白酶K對(duì)結(jié)果幾乎無(wú)影響。

其次裂解時(shí)間及裂解溫度對(duì)于裂解充不充分也影響較大。相同裂解溫度下的裂解時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響裂解效果，時(shí)間過(guò)短裂解不充分影響核酸釋放，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)造成核酸片段化；相同裂解時(shí)間下的裂解溫度高低也會(huì)影響裂解效果，溫度過(guò)低可能造成裂解不充分影響核酸釋放，溫度過(guò)高可能也會(huì)造成核酸降解風(fēng)險(xiǎn)，但實(shí)際上裂解溫度有可能是50-90°C。根據(jù)不同廠家的核酸提取儀性能和預(yù)分裝耗材的差異，程序設(shè)置溫度可能會(huì)與預(yù)分裝中實(shí)際運(yùn)行溫度相差10-20°C，裂解溫度及時(shí)長(zhǎng)需要根據(jù)裂解液的裂解能力做出選擇。

02 漂洗步驟
漂洗步驟對(duì)于復(fù)雜的豬場(chǎng)樣本種類來(lái)說(shuō)也是重要步驟，漂洗液的漂洗能力對(duì)于背景干凈的樣本和背景復(fù)雜的樣本需要做到兼容，既不能造成簡(jiǎn)單樣本的核酸損失，也需要做到對(duì)復(fù)雜樣本除雜的效果。同樣地，漂洗次數(shù)和漂洗時(shí)間長(zhǎng)短也需要做到對(duì)簡(jiǎn)單樣本和復(fù)雜樣本地兼容。

03 洗脫步驟  
核酸提取試劑洗脫液一般為低鹽緩沖液或 RNase Free ddH₂O。洗脫步驟影響核酸提取的因素是洗脫時(shí)間和溫度，與裂解步驟類似，洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者過(guò)短，洗脫溫度過(guò)高或者過(guò)低，都可能會(huì)對(duì)核酸從磁珠中的洗脫效率和核酸降解產(chǎn)生影響。洗脫時(shí)間和溫度的選擇需要根據(jù)提取病毒的特點(diǎn)及下游擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行選擇。

此外，除了核酸提取，真實(shí)結(jié)果的產(chǎn)出還需要提取后靈敏高效的熒光定量檢測(cè)試劑。正如上文提到的，豬場(chǎng)的環(huán)境紗布樣本和唾液樣本含量其中含有較多的泥土、飼料、唾液粘蛋白、糞便等成分，如果說(shuō)提取試劑對(duì)此類樣本提取的核酸純度不夠，含有較多腐殖酸等抑制物，或者搭配了抗逆效果不太好的下游擴(kuò)增試劑盒，此時(shí)很容易抑制擴(kuò)增。所以下游擴(kuò)增選用抗逆性好和擴(kuò)增靈敏度高的擴(kuò)增試劑盒對(duì)于結(jié)果的準(zhǔn)確度也是至關(guān)重要的。

濟(jì)凡生物致力于成為國(guó)內(nèi)領(lǐng)先的生物樣本保存、提取、檢測(cè)整體解決方案的科技創(chuàng)新型公司。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期探索與創(chuàng)新，濟(jì)凡現(xiàn)已擁有一套成熟的核酸純化體系，以其優(yōu)異的操作便利性，樣本兼容性和高檢出率，深受客戶認(rèn)可，截止目前，已提供超過(guò)1500萬(wàn)頭份病毒提取試劑。大量數(shù)據(jù)表明濟(jì)凡磁珠法動(dòng)物病毒DNA/RNA提取試劑盒具有優(yōu)異的提取性能。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：
1.樣本兼容性好:通用提取各種DNA和RNA病毒樣本、包括唾液、拭子、紗布、全血、血清、組織勻漿液等各種樣本或各種病毒保存液中的樣本；
2.操作簡(jiǎn)單快速：配合自動(dòng)化提取儀，僅需加入樣本，15min即可完成提��；
3.高檢出率：病毒提取效率高，尤其對(duì)低拷貝病毒樣本具有較優(yōu)的檢出性能。

▼樣本兼容性好

 

▼競(jìng)品對(duì)比數(shù)據(jù)

參考文獻(xiàn)：

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