均相時(shí)間分辨熒光HTRF技術(shù)在心血管疾病研究上的應(yīng)用

本文涉及應(yīng)用技術(shù)：均相時(shí)間分辨熒光（HTRF&TR-FRET）。來(lái)看研究人員是如何利用HTRF技術(shù)助推心血管疾病的研究的吧。
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一氧化氮信號(hào)通路研究
一氧化氮（NO）是自分泌和旁分泌的信號(hào)通路分子，可以擴(kuò)散進(jìn)入生物膜。發(fā)揮作用時(shí)間很短，促進(jìn)血管動(dòng)態(tài)平衡。能夠抑制平滑肌收縮生長(zhǎng)，阻止血小板凝聚以及防止白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附。另外它還參與免疫防御系統(tǒng)，神經(jīng)傳遞，血管生成等過(guò)程。研究表明，這種配體/受體長(zhǎng)期低表達(dá)可能是高血壓、心力衰竭、心肌梗死、中風(fēng)和死亡的發(fā)病的關(guān)鍵。因此，NO-sGC信號(hào)通路廣泛用于可恢復(fù)功能缺陷的治療藥物的研究。

2011年，Ramanathan等人在研究新發(fā)現(xiàn)的sCG抑制劑血栓反應(yīng)蛋白-1(TH-1)，這是一種與多種膜受體(包括CD47)結(jié)合的多結(jié)構(gòu)域蛋白。他們對(duì)活細(xì)胞和細(xì)胞裂解物進(jìn)行了HTRF cGMP檢測(cè)，以評(píng)估在NO存在的情況下，各種情況對(duì)sGC活性的影響。結(jié)果表明，TH-1的E3CaG1片段與CD47結(jié)合時(shí)，抑制NO-sGC信號(hào)(圖2.A)。在E3CaG1存在下，加入CD47抗體，NO-sGC信號(hào)增強(qiáng)(圖2.B)。此外，E3CaG1與CD47結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，cGMP減少(圖2.C)。
 

藥物的發(fā)現(xiàn)
2018年，Tobin等人研究IW-1973，一種新開(kāi)發(fā)的sGC激動(dòng)劑。作者通過(guò)HTRF技術(shù)檢測(cè)cGMP、總VASP和磷酸化VASP（Ser 239）來(lái)檢測(cè)其功能。結(jié)果表明，在30mM NO條件下，IW-1973激活sGC，EC50為267 nM。對(duì)cGMP的影響很低，對(duì)VASP磷酸化的影響達(dá)到峰值為78%。

藥物的高通量篩選
高甘油三酯水平與心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。載脂蛋白CIII(ApoC-III)（在脂解和脂質(zhì)合成中的作用）是它們的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和治療應(yīng)用的合理靶點(diǎn)之一。

2017年，Jun Lee和Mahankali等人旨在識(shí)別可能顯示出治療效果的ApoC-III的小分子抑制劑。使用HTRF ApoC-III檢測(cè)，他們篩選了超過(guò)95萬(wàn)種化合物，并確定了抑制率高于50%的化合物，并對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的研究（圖4）。

結(jié)果顯示，反式維甲酸(atRA)可能是有效的抑制劑。被認(rèn)為是與兩個(gè)受體家族相關(guān)(RARs和RXRs)，作者進(jìn)一步使用HTRF載脂蛋白分析來(lái)確定atRA對(duì)ApoC-III的影響僅是通過(guò)RARs介導(dǎo)的。

總的來(lái)說(shuō)，對(duì)ApoC-III分泌的各種RAR受體激動(dòng)劑進(jìn)行了研究。AM580最有效的減少ApoC-III分泌，有效改善高脂飲食小鼠的體重、肝臟狀況、心臟狀況和甘油三酯水平。這些研究表明，一種RARα特異性激動(dòng)劑可能為降脂和降低CVD風(fēng)險(xiǎn)提供了一種新的策略。

表征配體的功能研究--新開(kāi)發(fā)抗β-Arestin受體配體
β-Arestin是一種多功能信號(hào)蛋白，主要作用于GPCR脫敏，通過(guò)β-1-腎上腺素能受體激活EGFR/ERK信號(hào)，已被認(rèn)為在心力衰竭模型中具有心臟保護(hù)作用。

為了更好地和直接觀(guān)察表達(dá)β-Arestin受體（βAR）的細(xì)胞和組織的生理和病理功能，Mitronova等人（2017）開(kāi)發(fā)此類(lèi)受體的熒光配體。用熒光基團(tuán)標(biāo)記已知的βAR拮抗劑卡唑洛爾和激動(dòng)劑BI-167107，米特羅諾娃的團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了配體-受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和生物活性的分析。HTRF Tag-lite β1AR或 β2AR分析來(lái)確定解離常數(shù)（Kd），通過(guò)檢測(cè)cAMP分析評(píng)估新配體的效力。

結(jié)語(yǔ)：該文章提供了HTRF技術(shù)在心血管相關(guān)研究的中的相關(guān)思路并得到驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。為心血管疾病研究的道路“開(kāi)辟捷徑”，主要研究思路包括：
①候選藥物的藥理特性分析；
②對(duì)潛在分子的化合物進(jìn)行高通量篩選：HTRF高通量篩選平臺(tái)；
③受體-配體相互作用的研究：HTRF Tag-lite（基于細(xì)胞膜受體-配體）；
④深入研究信號(hào)通路：磷酸化蛋白和總蛋白檢測(cè)，生物標(biāo)志物檢測(cè)。