Cell創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)：非編碼vtRNA可通過抑制P62寡聚化影響細(xì)胞自噬

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的重要途徑，用于識別，去除和降解自噬小體內(nèi)的胞內(nèi)成分，細(xì)胞器以及病原體。自從被評為國自然重點以來，自噬的熱度一直居高不下。小優(yōu)回顧了一下之前發(fā)的幾篇自噬相關(guān)的文章，都有較高的閱讀量。

LC3：隱秘的自噬標(biāo)記物！
Nature:自噬促進胰腺癌免疫逃逸的機制
自噬與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系一文帶你吃透，不點進來看看？

非編碼RNA也是今年的國自然熱點，是指一類不參與編碼蛋白質(zhì)的RNA，但具有調(diào)節(jié)基因表達和蛋白質(zhì)功能的特性，主要包括microRNA，siRNA，lncRNA，vtRNA等等。在最近幾年，非編碼RNA文章數(shù)也增長迅速。

近十年P(guān)ubMed非編碼RNA相關(guān)文獻數(shù)

今天小優(yōu)就從Cell期刊中為大家撈出了一篇關(guān)于自噬和非編碼RNA的精品高分文章。這篇文章來自德國海德堡的Matthias W. Hentze教授在Cell發(fā)表研究：The Small Non-coding Vault RNA1-1 Acts as a Riboregulator of Autophagy，希望能給大家提供更多的思路。

文章概述：
本文表明了vault RNA直接結(jié)合自噬受體sequestosome-1/p62。過表達vtRNA1-1抑制p62依賴的自噬。細(xì)胞饑餓會降低vtRNA1-1和P62的結(jié)合，從而誘導(dǎo)自噬。P62不能結(jié)合vtRNA的突變會增加P62的寡聚化，并增加和自噬效應(yīng)物的關(guān)系。因此，vtRNA1-1可以通過集合P62和干擾寡聚化，從而直接調(diào)節(jié)自噬。

文章亮點：

文章首次發(fā)現(xiàn)并研究了P62和RNA的相互作用。該研究首次將自噬相關(guān)蛋白P62定性為RNA結(jié)合蛋白，并發(fā)現(xiàn)vtRNA可通過抑制P62的寡聚化，從而影響細(xì)胞自噬。

接下來小優(yōu)就帶大家具體來解析下這篇文章，看看作者的研究思路和實驗方法。

1、自噬受體p62/SQSTM1是RNA結(jié)合蛋白
故事開始于作者使用了RBDmap技術(shù)鑒定RNA結(jié)合蛋白中與RNA相互作用的肽段。在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有一個肽段來自于自噬受體p62/sequestosome-1，表明P62與RNA相互作用�？紤]到哺乳動物的自噬受體和RNA的相互作用還沒有人研究過，作者決定繼續(xù)研究。

作者使用WB和Co-IP技術(shù)進一步鑒定p62和RNA之間的關(guān)系。WB和Co-IP結(jié)果均顯示p62是一個RNA結(jié)合蛋白（Fig.1A and 1B）。然后作者用iCLIP技術(shù)確定是哪種RNA和p62結(jié)合。結(jié)果表明，有四種vault RNA和p62結(jié)合緊密。更多分析表明，p62優(yōu)先結(jié)合在vtRNA的中心結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀區(qū)域（Fig. 1C,1D and 1E）。

綜上，結(jié)果顯示，p62和vtRNA的中心結(jié)構(gòu)域有相互作用。

Fig.1 自噬受體p62是RNA結(jié)合蛋白

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號	名稱	用途
88588	SQSTM1/p62(D5L7G) Mouse mAb	抗體
3449	TDP43(A260) Antibody	抗體
10600023	PVDF 0.45UM 300MMx4M 1/PK	PVDF轉(zhuǎn)印膜
10600002	PT 0.45UM 300MMx4M 1/PK	NC轉(zhuǎn)印膜
abs955	免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒	Co-IP試劑盒
17127901	RPROTEIN A SEPHAROSE FF	ProteinA瓊脂糖
17061801	PROTEIN G SEPHAROSE 4 FF	ProteinG瓊脂糖
SH20022	DMEM高糖培養(yǎng)基	培養(yǎng)基
SH30809	RPMI 1640培養(yǎng)基	培養(yǎng)基
SH30406.05	新西蘭胎牛血清	血清

2、Vault RNA 1-1是P62主要結(jié)合的RNA
作者進一步驗證vtRNA和p62的相互作用。作者使用了p62 RIP-qPCR技術(shù)進行驗證。作者發(fā)現(xiàn)vtRNA1-1是p62主要結(jié)合的RNA（Fig. 2A）。作者在多個細(xì)胞系進行驗證（Fig. 2B and 2C）。

接著作者用純化的蛋白和放射性標(biāo)記的RNA進行EMSA實驗。作者在構(gòu)建p62的質(zhì)粒的時候在N端加上了MBP標(biāo)簽，然后用MBP的填料進行純化。結(jié)果表明MBP-62和vtRNA1-1形成復(fù)合物。

為了驗證MBP-p62和vtRNA1-1的相互作用是否是特異性的，作者使用非標(biāo)記的tRNA作為特異性的競爭者，IRE或者細(xì)菌tRNA作為非特異性的競爭進行實驗。結(jié)果表明，非標(biāo)記的tRNA可以有效的和標(biāo)記的vtRNA競爭，而IRE或者細(xì)菌tRNA不能競爭（Fig.2D）。

綜上，p62在體外可以特異性的結(jié)合vtRNA1-1。

Fig.2 P62結(jié)合Vault RNA1-1

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號	名稱	用途
abs60093	Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit	qRT-PCR試劑盒
28918780	MBPTrap	蛋白純化柱
28935597	Dextrin Sepharose High Performance	蛋白純化填料
29148721	Superdex 75 Increase 10/300	蛋白純化柱
28990944	Superdex 200 increase 10/300	蛋白純化柱

3、vtRNA1-1抑制p62介導(dǎo)的自噬
接下來作者想要繼續(xù)研究vtRNA1-1和p62相互作用的意義。首先作者驗證p62會不會介導(dǎo)vtRNA的溶酶體降解。結(jié)果表明，無論是在p62干擾或者敲除的細(xì)胞中，vtRNA的表達水平都沒有影響（Fig 2F and 2G）。

接下來作者進行反向研究，看看vtRNA1-1會不會影響p62在自噬中的功能。作者在細(xì)胞中敲低 vtRNA1-1，監(jiān)測自噬流通過檢測兩個參數(shù)，LC3B-1到LC3B-II在自噬體組裝中的轉(zhuǎn)換，以及p62的水平反映自噬溶酶體降解。結(jié)果表明，vtRNA1-1敲低會刺激LC3B的轉(zhuǎn)換（Fig. 3A and 3B），表明自噬流的增加。為了驗證這個現(xiàn)象是否依賴于p62，作者同時去除了p62和vtRNA1-1。作者發(fā)現(xiàn)，去除P62會部分減緩LC3B的轉(zhuǎn)換速率在vtRNA1-1敲除之后（Fig. 3C）。免疫熒光實驗也顯示，vtRNA1-1的去除表現(xiàn)為LC3B數(shù)量增加（Fig. 3D and 3E）。

作者也檢測了vtRNA1-1表達增加會發(fā)生什么。檢測發(fā)現(xiàn)，vtRNA1-1表達增加會抑制LC3B的轉(zhuǎn)換，并且會引起p62的積累（Fig. 3G），表明自噬流的下降。相對的，其他vtRNA的過表達不會影響LC3B的轉(zhuǎn)換速率。

綜上，vtRNA1-1表達上調(diào)和下調(diào)都會影響p62依賴的自噬。

Fig.3 vtRNA調(diào)節(jié)P62依賴的自噬

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號	名稱	用途
101000046	jetPRIME	轉(zhuǎn)染試劑
2775	LC3B Antibody	抗體
4408	Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa Fluor 488 Conjugate)	熒光抗體
4413	Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa Fluor 555 Conjugate)	熒光抗體

4、p62結(jié)合vtRNA1-1主要通過鋅指結(jié)構(gòu)域

為了研究vtRNA1-1抑制p62功能的機制，作者決定構(gòu)建一些p62的突變體。P62有多個結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域都有對應(yīng)的功能，但是沒有傳統(tǒng)的RNA結(jié)合的區(qū)域（Fig. 5A）。為了鑒定p62的RNA結(jié)合區(qū)域，作者使用RBDmap數(shù)據(jù)并且檢查了在ZZ結(jié)構(gòu)域中RBDpep附近的區(qū)域（Fig. 5A and 5B）。作者從HuH-7細(xì)胞中敲低內(nèi)源的p62，然后將一些p62變體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。結(jié)果表明，p62 K141A變體展現(xiàn)了很強的降低RNA結(jié)合的作用(Fig. 5C)。

接著，作者用P62 KO細(xì)胞進行驗證。作者使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了HuH-7 P62 KO的細(xì)胞株。然后轉(zhuǎn)染一個三突變體，R21A，D69A和D73A。p62 PB1m也同樣會降低RNA的結(jié)合（Fig. 5D）。

綜上，p62主要通過鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合vtRNA1-1。

Fig. 5 P62結(jié)合vtRNA1-1主要通過鋅指結(jié)構(gòu)域

5、vtRNA調(diào)節(jié)p62和Atg8蛋白家族的相互作用

作者進一步對下游機制進行研究。首先作者驗證是否RNA的結(jié)合會影響p62和Atg8蛋白家族的LC3B和GABARAP的相互作用。通過Co-IP實驗，作者發(fā)現(xiàn)敲低vtRNA1-1，P62和LC3B的相互作用降低（Fig. 6A）。同樣的現(xiàn)象也表現(xiàn)在vtRNA1-1 KO的HuH-7細(xì)胞中(Fig. 6B)。

作者進一步使用p62 KO的HuH-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染p62 WT，PK/A和PB1m質(zhì)粒。結(jié)果表明，p62 RK/A表現(xiàn)出和GABARAB更強的相互作用（Fig. 6C and 6D）。而p62 PB1m展現(xiàn)出對LC3，GABARAP和NBR1較低的結(jié)合（Fig. 6C and 6D）。

綜上，去除vault RNA1-1或者使P62 RNA結(jié)合缺失都會增加P62和LC3B和GABARAP的結(jié)合，這些數(shù)據(jù)表明vault RNA1-1的結(jié)合影響P62和Atg8蛋白家族的相互作用。

Fig. 6 vtRNA1-1影響P62和Atg8蛋白家族的相互作用

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號	名稱	用途
13733	GABARAP(E1J4E) Rabbit mAb	抗體
abs153912	Rabbit anti-NBR1 Polyclonal Antibody	抗體

總結(jié)
在這篇文章里，作者使用了多種方法研究vtRNA和P62的相互作用以及對自噬的影響，例如Co-IP，iCLP，RIP-qPCR，EMSA，CRISPR/Cas9，蛋白純化等等。具體的實驗方法在文獻中都有詳細(xì)介紹。今天想為大家重點介紹一下蛋白純化的方法。

為了更加方便的改造蛋白或者更加便宜和便捷的大量得到某種目標(biāo)蛋白，現(xiàn)在越來越多的實驗室都在選擇蛋白純化的方法進行蛋白的純化和改造。蛋白純化的步驟主要分為：質(zhì)粒構(gòu)建——蛋白表達——蛋白純化，可以選擇使用原核或者真核生物作為表達體系。具體的操作方法和視頻，大家可以點擊查看原核標(biāo)簽蛋白純化解決方案，里面有詳細(xì)的操作步驟和視頻提供給大家，千萬不要錯過哦！

像文章中純化P62時加上的MBP和His標(biāo)簽也是蛋白純化常用的標(biāo)簽。首先作者構(gòu)建了MBP-p62-his質(zhì)粒，然后在 E.coli BL21(DE3)大腸桿菌表達體系中進行表達。在37℃培養(yǎng)了6小時之后，細(xì)胞恢復(fù)到室溫，然后在20℃繼續(xù)培養(yǎng)16H。細(xì)胞加入裂解液 (50mM HEPES pH 8.0, 1M NaCl, 0.5 mM TCEP, 1x protease inhibitor)，并且使用超聲進行裂解。然后用His標(biāo)簽預(yù)裝柱和MBP標(biāo)簽預(yù)裝柱進行純化。

常見的純化標(biāo)簽及區(qū)別