蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）工作原理及操作流程

 

WB 實驗包括制樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體和顯影等多個步驟（如圖 1），莫慌莫慌，小 M 帶你來一一化解。

^{圖 1. Western blot 的流程圖[2]}

要想實驗節(jié)奏穩(wěn)，準備工作那可要妥妥的——緩沖液配制。小 M 在此總結(jié)了 WB 實驗中所涉及的各類緩沖液的配方，拿走拿走別客氣～

 

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表 1. Western blotting 各類緩沖液配方

默默問一句，看完這些配方，您倦了嗎？瘋狂計算，反復(fù)稱量，您累了嗎？小 M 且在這里為您獻上 MCE 多種速溶顆粒產(chǎn)品 (可戳往期→讓“速溶顆粒”解放你的雙手)，不用猶豫，省時省力，您且受累收好唄！

配好了溶液，就該輪到把樣品的蛋白分離出來了！那么樣品處理該注意什么呢？

低溫操作！低溫操作！低溫操作！重要的事說三遍。為最大限度保證蛋白原有結(jié)構(gòu)，所有涉及蛋白的操作都需在冰上進行！

1. 細胞裂解液的制備。在冰上用預(yù)冷的 PBS 洗滌細胞。根據(jù)每 10⁷ 個細胞加 1 mL 裂解緩沖液的比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液。細胞重懸液在 4 ℃ 下放置 5-10 分鐘，期間劇烈震蕩 3-4 次，每次 30 秒，實現(xiàn)充分裂解。放入離心機內(nèi)，12,000 rpm 離心 13-15 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的離心管中，棄去沉淀。

如果是制備組織裂解液的話，解剖目標組織一定要迅速，建議多次離心去除雜質(zhì)。

2. 蛋白樣本制備。取少量裂解液，通過 BCA 法進行蛋白濃度測定。取出 50 μg 蛋白對應(yīng)的溶液至離心管中，加入 1×SDS 上樣緩沖液調(diào)平體積。將樣本緩沖液中的細胞裂解液在 100 ℃ 下煮沸 5-10 分鐘。

緊張又忙碌地制備完蛋白樣品，然后就是上樣和跑膠。(恰恰恰，跑個膠，先檢查下作業(yè)唄！) 首先是根據(jù)蛋白大小選擇合適的凝膠，參考下表 2。

然后將蛋白樣品上樣至 SDS-PAGE 凝膠孔中，記得在樣品旁邊的孔內(nèi)點上 marker。細胞裂解液或組織勻漿的總蛋白上樣量一般為 20-30 μg，電泳時長一般 1.5 小時，先用 80 V 跑 30分鐘，使各樣本處于同一水平，待 marker 開始分離后將電壓調(diào)至 120 V 再跑 1小時。

表 2. 蛋白大小與推薦的凝膠百分比

順利到了轉(zhuǎn)膜這一步，已經(jīng)快完成實驗啦~ 轉(zhuǎn)膜分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)兩種，轉(zhuǎn)膜時間應(yīng)根據(jù)蛋白大小進行相應(yīng)調(diào)整。

濕轉(zhuǎn)是指轉(zhuǎn)印過程中凝膠和膜被浸入充滿轉(zhuǎn)印緩沖液的槽中，適用于大多數(shù)各種分子量的常規(guī)蛋白轉(zhuǎn)印。半干轉(zhuǎn)是指凝膠和膜被夾在預(yù)先潤濕緩沖液的濾紙之間，濾紙與平板電極直接接觸。濕轉(zhuǎn)使用更廣泛，成本低；半干轉(zhuǎn)相對來說更加節(jié)約時間，通常只需要 10 min 即可，具體時間視蛋白大小和儀器條件決定。不論是半干轉(zhuǎn)還是濕轉(zhuǎn)，小 M 都有幾個共通小 tips 要給你：
1 提前將 PVDF 膜浸入預(yù)冷的甲醇中 5s 來激活；
2 轉(zhuǎn)膜時要注意趕走膜與膠之間的氣泡；
3 轉(zhuǎn)膜材料的放置順序（如圖 2a）

圖 2. 轉(zhuǎn)膜的物料順序：陰極，海綿 (濕轉(zhuǎn)需要)，濾紙，膠，PVDF 膜，濾紙，海綿 (濕轉(zhuǎn)需要)，陽極^[3]

行百里者半于九十，大家在最后一步一定要堅持！
通常，在孵育一抗前需要用封閉緩沖液在室溫下封閉膜 1 小時，以使膜表面可有效地附著蛋白質(zhì)或抗體，然后用 PBST 洗滌膜 3 次，每次 5 分鐘，接著將封閉后的膜與稀釋后的一抗在 4 ℃ 下過夜孵育。
洗滌后使用稀釋后的偶聯(lián)二抗在封閉緩沖液中室溫孵育 2 小時，用 PBST 洗滌后加入 ECL 顯色液孵育 1-3 分鐘，利用暗室顯影技術(shù)采集化學發(fā)光圖像。
(注意注意：加入 ECL 顯色液后應(yīng)全程避光！否則前功盡棄。)
看到這里，相信大家對 western blot 的流程已經(jīng)了然于心了吧，是不是迫不及待地想上手練習啦 一通操作猛如虎，一看結(jié)果想哭。WB 結(jié)果有問題怎么辦？別怕！萬能的小 M 仍有對策！詳情可戳→我就不信這個邪！打破 Western Blot玄學操作。
最后，貼心、暖心的小 M給大家奉上一系列相關(guān)產(chǎn)品，助大家一臂之力，快來看下吧

相關(guān)產(chǎn)品

RIPA 裂解液 (強) 傳統(tǒng)的細胞、組織快速裂解液，適用于 Western Blot (WB)、免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 等實驗。

磷酸酶抑制劑 Cocktail III (EDTA-Free, 10× in ddH2O) 是一種質(zhì)譜兼容的通用型蛋白和磷酸酶抑制劑 cocktail。

Tris-甘氨酸-SDS 速溶顆粒 (1 L of 1×) 常用作 SDS-PAGE 緩沖液，也可用作 WB 緩沖液。

快速封閉液速溶顆粒 (100 mL of 1×) 常用于 Western Blot 和 ELISA 的抗體封閉步驟，可在 15 分鐘內(nèi)完成封閉。

PBS-T 速溶顆粒 (1 L of 1×) 常用作 ELISA、Western Blot 等免疫分析實驗中的洗滌緩沖液，也可用于抗體稀釋及封閉液的配制。

TBS-T 速溶顆粒 (1 L of 1×) 常用作免疫組化、原位雜交、酶聯(lián)免疫等實驗中的洗滌緩沖液，也可用于抗體稀釋及封閉液的配制。

3-Color Prestained Protein Marker 分子量范圍為 10-190 kDa。

Ultra High Sensitivity ECL Kit 用于檢測辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。

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參考文獻

[1] Mahmood T, Yang PC, et al. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 2012 Sep;4(9):429-34.

[2] Meftahi, GH, Bahari, Z, Zarei Mahmoudabadi, A, Iman, M, Jangravi, Z , et al. Applications of western blot technique: From bench to bedside. Biochem Mol Biol Educ. 2021; 49: 509– 517.

[3] Wenying Pan, Wei Chen, and Xingyu Jiang, et al. Analytical Chemistry 2010 82 (10), 3974-3976