免疫印跡試驗(yàn)Western blot的操作步驟和注意事項(xiàng)

 

WB 實(shí)驗(yàn)包括制樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體和顯影等多個(gè)步驟（如圖 1），莫慌莫慌，小 M 帶你來(lái)一一化解。

^{圖 1. Western blot 的流程圖[2]}

要想實(shí)驗(yàn)節(jié)奏穩(wěn)，準(zhǔn)備工作那可要妥妥的——緩沖液配制。小 M 在此總結(jié)了 WB 實(shí)驗(yàn)中所涉及的各類(lèi)緩沖液的配方，拿走拿走別客氣～

 

表 1. Western blotting 各類(lèi)緩沖液配方

默默問(wèn)一句，看完這些配方，您倦了嗎？瘋狂計(jì)算，反復(fù)稱(chēng)量，您累了嗎？小 M 且在這里為您獻(xiàn)上 MCE 多種速溶顆粒產(chǎn)品 (可戳往期→讓“速溶顆粒”解放你的雙手)，不用猶豫，省時(shí)省力，您且受累收好唄！

配好了溶液，就該輪到把樣品的蛋白分離出來(lái)了！那么樣品處理該注意什么呢？

低溫操作！低溫操作！低溫操作！重要的事說(shuō)三遍。為最大限度保證蛋白原有結(jié)構(gòu)，所有涉及蛋白的操作都需在冰上進(jìn)行！

1. 細(xì)胞裂解液的制備。在冰上用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞。根據(jù)每 10⁷ 個(gè)細(xì)胞加 1 mL 裂解緩沖液的比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液。細(xì)胞重懸液在 4 ℃ 下放置 5-10 分鐘，期間劇烈震蕩 3-4 次，每次 30 秒，實(shí)現(xiàn)充分裂解。放入離心機(jī)內(nèi)，12,000 rpm 離心 13-15 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的離心管中，棄去沉淀。

如果是制備組織裂解液的話，解剖目標(biāo)組織一定要迅速，建議多次離心去除雜質(zhì)。

2. 蛋白樣本制備。取少量裂解液，通過(guò) BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取出 50 μg 蛋白對(duì)應(yīng)的溶液至離心管中，加入 1×SDS 上樣緩沖液調(diào)平體積。將樣本緩沖液中的細(xì)胞裂解液在 100 ℃ 下煮沸 5-10 分鐘。

緊張又忙碌地制備完蛋白樣品，然后就是上樣和跑膠。(恰恰恰，跑個(gè)膠，先檢查下作業(yè)唄！) 首先是根據(jù)蛋白大小選擇合適的凝膠，參考下表 2。

然后將蛋白樣品上樣至 SDS-PAGE 凝膠孔中，記得在樣品旁邊的孔內(nèi)點(diǎn)上 marker。細(xì)胞裂解液或組織勻漿的總蛋白上樣量一般為 20-30 μg，電泳時(shí)長(zhǎng)一般 1.5 小時(shí)，先用 80 V 跑 30分鐘，使各樣本處于同一水平，待 marker 開(kāi)始分離后將電壓調(diào)至 120 V 再跑 1小時(shí)。

表 2. 蛋白大小與推薦的凝膠百分比

順利到了轉(zhuǎn)膜這一步，已經(jīng)快完成實(shí)驗(yàn)啦~ 轉(zhuǎn)膜分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)兩種，轉(zhuǎn)膜時(shí)間應(yīng)根據(jù)蛋白大小進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

濕轉(zhuǎn)是指轉(zhuǎn)印過(guò)程中凝膠和膜被浸入充滿(mǎn)轉(zhuǎn)印緩沖液的槽中，適用于大多數(shù)各種分子量的常規(guī)蛋白轉(zhuǎn)印。半干轉(zhuǎn)是指凝膠和膜被夾在預(yù)先潤(rùn)濕緩沖液的濾紙之間，濾紙與平板電極直接接觸。濕轉(zhuǎn)使用更廣泛，成本低；半干轉(zhuǎn)相對(duì)來(lái)說(shuō)更加節(jié)約時(shí)間，通常只需要 10 min 即可，具體時(shí)間視蛋白大小和儀器條件決定。不論是半干轉(zhuǎn)還是濕轉(zhuǎn)，小 M 都有幾個(gè)共通小 tips 要給你：
1 提前將 PVDF 膜浸入預(yù)冷的甲醇中 5s 來(lái)激活；
2 轉(zhuǎn)膜時(shí)要注意趕走膜與膠之間的氣泡；
3 轉(zhuǎn)膜材料的放置順序（如圖 2a）

圖 2. 轉(zhuǎn)膜的物料順序：陰極，海綿 (濕轉(zhuǎn)需要)，濾紙，膠，PVDF 膜，濾紙，海綿 (濕轉(zhuǎn)需要)，陽(yáng)極^[3]

行百里者半于九十，大家在最后一步一定要堅(jiān)持！
通常，在孵育一抗前需要用封閉緩沖液在室溫下封閉膜 1 小時(shí)，以使膜表面可有效地附著蛋白質(zhì)或抗體，然后用 PBST 洗滌膜 3 次，每次 5 分鐘，接著將封閉后的膜與稀釋后的一抗在 4 ℃ 下過(guò)夜孵育。
洗滌后使用稀釋后的偶聯(lián)二抗在封閉緩沖液中室溫孵育 2 小時(shí)，用 PBST 洗滌后加入 ECL 顯色液孵育 1-3 分鐘，利用暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像。
(注意注意：加入 ECL 顯色液后應(yīng)全程避光！否則前功盡棄。)
看到這里，相信大家對(duì) western blot 的流程已經(jīng)了然于心了吧，是不是迫不及待地想上手練習(xí)啦 一通操作猛如虎，一看結(jié)果想哭。WB 結(jié)果有問(wèn)題怎么辦？別怕！萬(wàn)能的小 M 仍有對(duì)策！詳情可戳→我就不信這個(gè)邪！打破 Western Blot玄學(xué)操作。
最后，貼心、暖心的小 M給大家奉上一系列相關(guān)產(chǎn)品，助大家一臂之力，快來(lái)看下吧

相關(guān)產(chǎn)品

RIPA 裂解液 (強(qiáng)) 傳統(tǒng)的細(xì)胞、組織快速裂解液，適用于 Western Blot (WB)、免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 等實(shí)驗(yàn)。

磷酸酶抑制劑 Cocktail III (EDTA-Free, 10× in ddH2O) 是一種質(zhì)譜兼容的通用型蛋白和磷酸酶抑制劑 cocktail。

Tris-甘氨酸-SDS 速溶顆粒 (1 L of 1×) 常用作 SDS-PAGE 緩沖液，也可用作 WB 緩沖液。

快速封閉液速溶顆粒 (100 mL of 1×) 常用于 Western Blot 和 ELISA 的抗體封閉步驟，可在 15 分鐘內(nèi)完成封閉。

PBS-T 速溶顆粒 (1 L of 1×) 常用作 ELISA、Western Blot 等免疫分析實(shí)驗(yàn)中的洗滌緩沖液，也可用于抗體稀釋及封閉液的配制。

TBS-T 速溶顆粒 (1 L of 1×) 常用作免疫組化、原位雜交、酶聯(lián)免疫等實(shí)驗(yàn)中的洗滌緩沖液，也可用于抗體稀釋及封閉液的配制。

3-Color Prestained Protein Marker 分子量范圍為 10-190 kDa。

Ultra High Sensitivity ECL Kit 用于檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。

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參考文獻(xiàn)

[1] Mahmood T, Yang PC, et al. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 2012 Sep;4(9):429-34.

[2] Meftahi, GH, Bahari, Z, Zarei Mahmoudabadi, A, Iman, M, Jangravi, Z , et al. Applications of western blot technique: From bench to bedside. Biochem Mol Biol Educ. 2021; 49: 509– 517.

[3] Wenying Pan, Wei Chen, and Xingyu Jiang, et al. Analytical Chemistry 2010 82 (10), 3974-3976