外泌體介紹、提取與純化方法及在科研領(lǐng)域的應(yīng)用

此前，小 M 已經(jīng)給大家介紹過(guò)外泌體了，它是由細(xì)胞分泌的包含 RNA 和蛋白質(zhì)的小囊泡，廣泛存在于血液、唾液、尿液及乳汁等體液中，具有細(xì)胞信使功能，參與細(xì)胞通訊。

 

外泌體是目前為止定義最為明確的細(xì)胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs)，其生成過(guò)程、釋放途徑、大小及功能區(qū)別于微囊泡 (Microvesicles) 和凋亡小體 (Apoptosis bodies)。

 

表 1. 外泌體、微囊泡和凋亡小體的區(qū)別

 

外泌體最早于 1983 年發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中；2013 年，三位國(guó)際科學(xué)家因 “發(fā)現(xiàn)并闡釋細(xì)胞囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)及其調(diào)控機(jī)制”，獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 

 

近幾年，外泌體更是成為科研寵兒，幾乎所有疾病領(lǐng)域都有它的身影：由于其廣泛存在于各種體液中，便于獲取和檢測(cè)，具有疾病診斷和預(yù)后檢測(cè)的應(yīng)用潛力；當(dāng)外泌體與靶向蛋白等一起進(jìn)行基因工程編輯，是優(yōu)選的治療藥物的遞送方案 (生物相容性更好，低免疫原性)。

 

今年 6 月 4 日，Nature biomedical engineering 報(bào)道了程柯教授團(tuán)隊(duì) Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine 一文。該文介紹了構(gòu)建的 SARS-CoV-2 的 RBD 抗原修飾的人源肺球細(xì)胞外泌體，作為可霧化吸入的 COVID-19 疫苗 (RBD-Exo 疫苗)，RBD-Exo 疫苗經(jīng)凍干后在室溫下穩(wěn)定 3 個(gè)月以上。并且由于外泌體的強(qiáng)同源靶向能力，RBD-Exo 疫苗被霧化吸入后在呼吸道及肺組織表現(xiàn)出更長(zhǎng)駐留時(shí)間，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，兩劑 RBD-Exo 疫苗可減弱重癥肺炎，并減少 SARS-CoV-2 活病毒感染后的炎癥浸潤(rùn)。

 

圖 2. RBD-Exo 疫苗制備示意圖^[2]

通過(guò)吸入進(jìn)入肺部。RBD-Exo 誘導(dǎo)倉(cāng)鼠產(chǎn)生抗 SARS-CoV-2 感染的 RBD 特異性 IgA 和 IgG 抗體，產(chǎn)生黏膜免疫和全身免疫。

總之，外泌體研究正如火如荼，想要研究好外泌體，首要任務(wù)就是獲得高純度的外泌體，小 M 帶大家一起看下常見(jiàn)的提取方法及各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)吧~

 

表 2. 不同外泌體提取方法優(yōu)缺點(diǎn)

 

■ 外泌體提取試劑盒，讓高純度外泌體獲得更 Easy!

 

圖 3. 外泌體提取步驟

 

 以上方法都可以對(duì)外泌體進(jìn)行富集和純化，大家可以根據(jù)需求選擇合適的提取方法，總有一款適合你哦~ 

獲得外泌體之后，如何對(duì)其進(jìn)行鑒定又是一個(gè)困擾研究者的問(wèn)題。國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì) (ISEV) 在 2014 年提議，對(duì)于分離獲得的外泌體需要從三個(gè)層面進(jìn)行鑒定：

■ WB 檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)情況

外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)目缒さ鞍准易?(CD63/CD81/CD9)、熱休克蛋白家族 (HSP60/HSP70/HSPA5/CCT2/HSP90) 和一些細(xì)胞特異性蛋白。其中 CD63/ TSG101 是最常用到的外泌體標(biāo)志物。

 

■ TEM 鑒定外泌體形態(tài)

電鏡具有較高的分辨率，可以直接觀察到樣品中外泌體的形態(tài)。

 

■ NTA 檢測(cè)外泌體粒徑及濃度

TEM 可以觀察外泌體的形態(tài)學(xué)特征，但無(wú)法體現(xiàn)樣本中所有外泌體的粒徑分布情況及整體濃度。NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) 技術(shù)可快速精準(zhǔn)地分析外泌體的粒徑分布及濃度，為外泌體鑒定提供有力證據(jù)。

 

上實(shí)例！

Muyu Yu 等人在研究經(jīng)阿伐他汀預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSC) 外泌體是否具有促血管生成能力時(shí)，對(duì) BMSC 來(lái)源的外泌體進(jìn)行了鑒定，如圖 4 所示：透射電鏡觀察到各組外泌體典型的球形、膜狀結(jié)構(gòu)。WB 分析顯示，分離的顆粒中均檢測(cè)到外泌體標(biāo)志蛋白 TSG101 和 CD81。NTA 結(jié)果表明，Exos 和 ATV-Exos 均在大約 80-120 nm 處顯示單峰。

 

圖 4. BMSC 來(lái)源的外泌體的鑒定^[3]

 

 

■ 對(duì)外泌體的標(biāo)記示蹤

在對(duì)外泌體的探索中，對(duì)分離的外泌體進(jìn)行體外標(biāo)記或活體示蹤，更助于對(duì)外泌體的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前對(duì)于外泌體的標(biāo)記和鑒定方法較多，主要包括親脂性染料和膜滲透型化合物等。

 

01 親脂類(lèi)染料示蹤

親脂類(lèi)染料 (DiO, DiI, DiD, DiR) 可以很好的對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記，也是外泌體研究中的常用染料 。

 

體外示蹤：如下圖 5，Exos 和 ATV-Exos 外泌體用 PKH26 紅色熒光標(biāo)記，細(xì)胞骨架和細(xì)胞核分別用鬼筆環(huán)肽和 DAPI 標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果表明：PKH26 標(biāo)記的外泌體 (紅) 定位于 HUVEC 細(xì)胞核周區(qū)域，證實(shí)了外泌體被內(nèi)化。

 

圖 5. HUVEC 對(duì) Exos 和 ATV-Exos 的攝取驗(yàn)證^[3]

  

體內(nèi)示蹤：

圖 6. DIR 標(biāo)記 4T1 外泌體在小鼠乳腺中的體內(nèi)成像圖^[4]

向有 4T1 腫瘤的Balb/c小鼠靜脈注射4T1外泌體。外泌體用親脂性熒光探針 DIR 標(biāo)記；在每幅圖像的右側(cè)給出了亮度效率的刻度。

 02 膜滲透型化合物示蹤

膜滲透型化合物 CFSE 也是一種親脂類(lèi)熒光染料，可被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。其本身無(wú)顏色，進(jìn)入細(xì)胞后脫去醋酸鹽基團(tuán)，生成羧基熒光素琥珀酰亞胺酯 (綠色熒光)，也常用來(lái)對(duì)外泌體進(jìn)行有效示蹤。

 

圖 7. CFSE 標(biāo)記胚胎組織外泌體共聚焦圖像^[5]

看了這么多，相信大家對(duì)外泌體有了更深的認(rèn)識(shí)。MCE 現(xiàn)已推出外泌體相關(guān)產(chǎn)品，心動(dòng)不如行動(dòng)，來(lái) MCE 官網(wǎng)查詢(xún)具體的產(chǎn)品信息吧！ 

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

 

 

 

 

參考文獻(xiàn)

1. Naveed Akbar, Valerio Azzimato, Robin P Choudhury, Myriam Aouadi, et al. Extracellular vesicles in metabolic disease. Diabetologia. 2019 Dec;62(12): 2179-2187.

2. Zhenzhen Wang, Kristen D Popowski, et al. Exosomes decorated with a recombinant SARS-CoV-2 receptor-binding domain as an inhalable COVID-19 vaccine. Nat Biomed Eng. 2022 Jul 4

 

3. Muyu Yu, Wei Liu, Junxian Li, et al. Exosomes derived from atorvastatin-pretreated MSC accelerate diabetic wound repair by enhancing angiogenesis via AKT/eNOS pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Aug 12;11(1):350.

 

4. Tyson Smyth, Max Kullberg, et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. J Control Release. 2015 Feb 10; 199: 145-55.

 

5. Samantha Sheller-Miller, Jayshil Trivedi, et al. Exosomes Cause Preterm Birth in Mice: Evidence for Paracrine Signaling in Pregnancy. Sci Rep. 2019 Jan 24;9(1):608