代謝組學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)LC-MS 技術(shù)研究過程詳解

代謝組學(xué)的主要目的是研究有機(jī)體在特定時(shí)間和空間下所表達(dá)的小分子代謝物的組成及含量變化，從而尋找代謝物與表型變化的相對(duì)關(guān)系。
為了幫助大家快速了解代謝組學(xué)，小 M 今日特地挑選了代謝組學(xué)中應(yīng)用最為廣泛也是最經(jīng)典的 LC-MS 技術(shù)來解鎖代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)篇，研究過程可分為研究設(shè)計(jì)、樣本準(zhǔn)備、儀器檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析 4 個(gè)主要步驟 (圖 1)^[1]。

 

 

圖 1. LC-MS 代謝組學(xué)的一般流程圖^[2]。

一個(gè)包含四個(gè)重要階段的 notame 工作流的總體概述

 

 

■ Part 1：研究設(shè)計(jì)

Q：代謝組學(xué)出現(xiàn)在生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域中，paper 更是數(shù)不勝數(shù)，我該如何開始設(shè)計(jì)呢

A：代謝組學(xué)更像一種研究技術(shù)和方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有 2 個(gè)關(guān)鍵內(nèi)容，小 M 給大家列出來了。

 

1. 明確科學(xué)問題并選擇合適的代謝組學(xué)技術(shù)：明確研究的科學(xué)問題及目標(biāo)代謝物，選擇合適的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)后續(xù)的研究能起到很好的指導(dǎo)作用。

 

表 1. 代謝組學(xué)技術(shù)選擇

 

2. 樣本選擇與設(shè)計(jì)

樣本的選擇通常是個(gè)性化的，需要依照具體的研究背景和目的進(jìn)行選擇，而樣本設(shè)計(jì)則有一定的共性：

1）由于代謝組定量一般是相對(duì)定量，所以需要設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組

2）每組樣本需要設(shè)置有生物學(xué)重復(fù)

 

■ Part 2：樣本準(zhǔn)備
接下來終于要開始動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)啦，由于代謝物會(huì)發(fā)生氧化降解，所有實(shí)驗(yàn)步驟都需要冰上進(jìn)行或者低溫操作~
1. 樣本收集與保存：首先各位小伙伴要依據(jù)研究背景及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，收集并處理樣本，常規(guī)樣本 (細(xì)胞等) 經(jīng) PBS 清洗后 4℃ 離心取沉淀，液體樣本冷凍離心后取上清，并轉(zhuǎn)到 EP 管中凍存于 -80℃ 冰箱。
2. 代謝物提取：每樣本加入 1 mL 預(yù)冷的提取試劑，震蕩后液氮速凍、超聲，低溫孵育 1 h 以上，隨后冷凍離心取上清，這一步的目的是充分沉淀蛋白質(zhì)并提取代謝物。接下來收集上清液凍干并加入 100 µL 復(fù)溶劑，充分溶解后冷凍離心取上清轉(zhuǎn)至 LC-MS 樣本瓶待測(cè) (圖 2)。
3. QC (Quality Control) 樣本準(zhǔn)備：每樣本中取出 10 µL 混合成 QC 樣本。

 

圖 2. 血漿樣本代謝組提取過程示例^[3]

 

■ Part 3：儀器檢測(cè)

LC-MS 檢測(cè)儀器多種多樣，小伙伴可以根據(jù)研究設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)條件自行選擇。除了需要選擇合適的儀器和方法外，還有兩點(diǎn)要注意：

 

1.  樣本檢測(cè)順序需隨機(jī)打亂，檢測(cè)前后需插入空白溶劑樣本及 QC 樣本，同時(shí) QC 樣本也需插入樣本序列進(jìn)行檢測(cè)，用于柱平衡、質(zhì)控、并輔助后續(xù)的數(shù)據(jù)分析^[4]。
2.  除了實(shí)驗(yàn)方法、儀器設(shè)備及參數(shù)存在差異，質(zhì)譜儀的信號(hào)也會(huì)隨時(shí)間發(fā)生偏移，即使質(zhì)譜儀可以定期校準(zhǔn)，但我們?nèi)匀唤ㄗh需進(jìn)行比較的樣本組要同一批次上機(jī)檢測(cè)。

■ Part 4：數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)分析可謂是代謝組學(xué)研究的 “關(guān)鍵限速步驟” (圖 3)，我們可以將它分解成 4 個(gè)步驟來完成：
1. 原始數(shù)據(jù)處理：通過基線校正、峰對(duì)齊、峰識(shí)別、缺失值填充、數(shù)據(jù)過濾、歸一化處理等方式將原始數(shù)據(jù)中的代謝物信息進(jìn)行提取并轉(zhuǎn)換成可用于數(shù)據(jù)分析的形式。
2. 統(tǒng)計(jì)分析：主要包含單統(tǒng)計(jì)分析 (Fold change、T test、Volcano Plot 等) 及多統(tǒng)計(jì)分析 (PCA、HCA、PLS-DA 等)，也可輔以機(jī)器學(xué)習(xí)建模的方法，一般是通過尋找差異表達(dá)的代謝物從而鎖定與研究背景相關(guān)的目標(biāo)物質(zhì)。
3. 代謝物鑒定：

目的是將 LC-MS 檢測(cè)信號(hào)匹配到對(duì)應(yīng)代謝物，分為標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫比對(duì)和算法預(yù)測(cè)兩種方式^[5]。

4. 功能分析："萬里長(zhǎng)征" 的最后一步，把結(jié)果解析好是代謝組的點(diǎn)睛之筆。然而要將功能注釋做得盡善盡美，通常還需要結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研與后續(xù)實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)。不過我們可以先通過通路鑒定，GESA 分析，通路富集分析，網(wǎng)絡(luò)分析等分析方法找到關(guān)鍵代謝通路與代謝物作為功能分析的切入點(diǎn)。

 

圖 3. 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析流程^[6]

典型的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析工作流程，包括數(shù)據(jù)原始處理、統(tǒng)計(jì)分析、功能注釋等過程。

 

以上就是一次經(jīng)典的代謝組學(xué)的全部實(shí)驗(yàn)流程啦，上期小 M 介紹了代謝組的基本知識(shí)和經(jīng)典案例，錯(cuò)過的同學(xué)們可以看一看~

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參考文獻(xiàn)

 

 

 

1. Mahmud, Iqbal, et al. "Decoding the metabolome and lipidome of child malnutrition by mass spectrometric techniques: present status and future perspectives." Analytical chemistry 91.23 (2019): 14784-14791.

2. Klåvus, Anton, et al. "“Notame”: Workflow for non-targeted LC–MS metabolic profiling." Metabolites 10.4 (2020): 135.

3. Chan, C. Y., et al. "Technology platform development for targeted plasma metabolites in human heart failure." Clinical proteomics 10.1 (2013): 1-9.

4.  Broadhurst, David, et al. "Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies." Metabolomics 14.6 (2018): 1-17.

5. Wandy, Joe, et al. "In silico optimization of mass spectrometry fragmentation strategies in metabolomics." Metabolites 9.10 (2019): 219.

6. Chong, Jasmine, Mai Yamamoto, and Jianguo Xia. "MetaboAnalystR 2.0: from raw spectra to biological insights." Metabolites 9.3 (2019): 57.
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