μ 型Opium受體激動(dòng)劑助力Fentanyl結(jié)構(gòu)的類(lèi)似物設(shè)計(jì)

副作用限制臨床應(yīng)用

Opioids的功能由四種 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCRs) 家族介導(dǎo)，即 μ、κ、δ 和傷害感受肽受體 (NOPR)，在這些Opium受體中，μ 型Opium受體 (μOR) 被發(fā)現(xiàn)是鎮(zhèn)痛和副作用的主要受體。有研究指出，Opium樣物質(zhì)誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用歸因于 μOR 的 Gi 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) (圖 1)，然而，其副作用 (呼吸抑制等) 究竟是由哪個(gè)信號(hào)通路產(chǎn)生，目前存在爭(zhēng)議：一種觀點(diǎn)認(rèn)為由 β-arrestin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起，另一觀點(diǎn)認(rèn)為與 G 蛋白門(mén)控的內(nèi)向整流鉀通道 (GIRK) 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

 

圖 1. Fentanyl和Morphine誘導(dǎo)的 μOR 信號(hào)傳遞和潛在的藥理作用^[1]

■ Fentanyl和Morphine如何進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)？

該研究首先表征了研究中使用的六種具有不同化學(xué)骨架的Opioids——Fentanyl、Morphine、SR17018、TRV130、PZM21 和  DAMGO(一種擬肽激動(dòng)劑，可激活 μOR-Gi 復(fù)合物，作為對(duì)照)——的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)情況。

如果所示 (圖 2a)，所有五個(gè)配體都能激活 μOR，以抑制 cAMP 的產(chǎn)生，F(xiàn)entanyl、Morphine和 PZM21 是完全激動(dòng)劑，而 SR17018 和 TRV130 是部分激動(dòng)劑。

在 β-arrestin 招募測(cè)定中沒(méi)有檢測(cè)到 PZM21 的反應(yīng)信號(hào)，而對(duì) SR17018 和 TRV130 只產(chǎn)生微弱的信號(hào)。相比之下，Morphine和Fentanyl都能誘導(dǎo)強(qiáng)大的 β-arrestin 招募 (圖 2b)�？偠�言之，Fentanyl和Morphine不僅能完全激活 μOR，還可誘導(dǎo)強(qiáng)大的 β-arrestin 招募。

圖 2. Opium類(lèi)激動(dòng)劑的 cAMP 積累和 β-arrestin 招募實(shí)驗(yàn)^[1]
a-b: Opium類(lèi)激動(dòng)劑的 cAMP 積累 (a) 和 β-arrestin2 (b) 招募的劑量依賴(lài)反應(yīng)曲線(xiàn)。DAMGO 為對(duì)照物，數(shù)據(jù)根據(jù) DAMGO 的最大反應(yīng)進(jìn)行歸一化。

圖 3. Fentanyl (a) 和Morphine (b) 與 μOR 的相互作用^[1]

此外，Fentanyl和Morphine配體結(jié)合袋周?chē)�的殘基突變，包�?nbsp;Y150^3.33、M153^3.36、V238^5.42、I298^6.51 和 H299^6.52，導(dǎo)致兩種配體對(duì) G 蛋白和 β-arrestin 信號(hào)的活性減弱 (圖 4a-b)。

圖 4. a: Fentanyl和Morphine對(duì) μOR 突變體的 Gi 激活減少所誘導(dǎo)的 cAMP 積累。每一欄的數(shù)值表示代表性的 μOR 突變體相對(duì)于 WT μOR的效力 (ΔpEC50) 的差異。b: Fentanyl (上) 和Morphine (下) 激活的小袋中 WT 和突變體 μORs 的 cAMP 測(cè)定^[1]
 
■ 引起 β-arrestin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素又是什么？
作者對(duì) μOR 正位結(jié)合口袋的殘基進(jìn)行了突變，并測(cè)試了這些突變體分別通過(guò)Fentanyl、Morphine和 DAMGO 激活 G 蛋白信號(hào)和 β-arrestin 招募的能力。
結(jié)果顯示，與 TM2 和 TM3 側(cè)的殘基相比，TM6 和 TM7 附近的殘基突變對(duì) β-arrestin 信號(hào)的影響更為明顯。比如，來(lái)自 TM6 的 W295A 和來(lái)自 TM7 的W320A 突變?cè)?cAMP 積累和 G 蛋白招募方面對(duì) G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)只有最小或部分影響，而它們幾乎取消了Fentanyl、Morphine和 DAMGO 誘導(dǎo)的 β-arrestin 招募 (圖 5b)。
這說(shuō)明，配體與 TM6/7 的相互作用對(duì)引起 β-arrestin 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。

圖 5. TM6/7 的代表性殘基的突變適度影響了 cAMP 反應(yīng)，但取消了Fentanyl (a)、morphine (b) 和DAMGO (c) 誘導(dǎo)的 β-arrestin 2 的招募^[1]

■ 設(shè)計(jì)分子降低 β-arrestin 活性了嗎？
為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)，作者設(shè)計(jì)了兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的Fentanyl衍生物 FBD1 (部分激動(dòng)劑) 和 FBD3 (完全激動(dòng)劑)，以獲得 β-arrestin 信號(hào)傳導(dǎo)減少/消失但 G 蛋白活性相對(duì)完整的 μOR 激動(dòng)劑 (圖 6a)，也就是說(shuō)，F(xiàn)BD1 和 FBD3 與μOR 的 TM6/7 之間的相互作用被削弱。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Fentanyl相比，F(xiàn)BD1 和 FBD3 都顯示出 β-arrestin 招募活性的極大降低，并且，F(xiàn)BD3 在 cAMP 抑制或 G_i 招募試驗(yàn)中顯示出與Fentanyl幾乎相同的效力和效率 (圖 6b-c)。

圖 6. (a) Fentanyl衍生物 FBD1 和 FBD3 的合成。(b-c) 以Fentanyl為對(duì)照物 (b) FBD1 和 FBD3 的cAMP 積累試驗(yàn)和 Gi 招募 (c) 的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)圖^[1]
該研究進(jìn)一步說(shuō)明了配體與 TM6/7 的相互作用對(duì)引起 μOR 的 β-arrestin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，減少這種相互作用可能導(dǎo)致配體優(yōu)先通過(guò) G 蛋白途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào) (圖 7)。

圖 7. μOR 的配體誘導(dǎo)的不同信號(hào)模型^[1]

參考文獻(xiàn)