銅死亡的觸發(fā)和檢測(cè)方法及銅的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)在抗腫瘤中的應(yīng)用

隨著銅死亡機(jī)制的確立[1][2]，相關(guān)研究也愈發(fā)受到各大期刊的 “寵愛”，往期小 M 為大家介紹過其詳細(xì)機(jī)制及與其他已知細(xì)胞程序性死亡的區(qū)別 (詳見往期推文：空降"熱搜" 銅死亡丨解鎖細(xì)胞死亡新方式; 熱度 “蹭蹭蹭”的銅死亡，你了解多少？)。

然而最吸引人的便是借助銅死亡這把利劍，刺向腫瘤細(xì)胞！那么今天這期銅死亡 “爆紅” 的背后故事就從腫瘤細(xì)胞的銅穩(wěn)態(tài)開始吧~

▐  腫瘤細(xì)胞的銅穩(wěn)態(tài)

銅是人體所需必需酶的輔助因子，可通過跨濃度梯度作用維持其穩(wěn)態(tài)。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)銅濃度保持在極低水平，在癌細(xì)胞中也是如此，銅離子的正常功能依賴于集中不同類型蛋白質(zhì)的相互作用：銅經(jīng)由血液系統(tǒng)運(yùn)輸，被轉(zhuǎn)送到細(xì)胞表面。Cu2+ 會(huì)被膜表面 STEAP 蛋白催化還原為 Cu+，而具備更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。進(jìn)入細(xì)胞的銅離子，依次通過 COX17 和 SLC25A3 穿過線粒體外膜和線粒體內(nèi)膜，進(jìn)入線粒體基質(zhì)。
當(dāng)然，還在細(xì)胞質(zhì)的銅離子也會(huì)與銅離子螯合劑 GSH 和 MT 結(jié)合，中和銅的細(xì)胞毒性，或被銅離子伴侶 CCS 攜帶至 SOD1，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡，多種環(huán)節(jié)共同參與細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[2]。

圖 1. 腫瘤細(xì)胞中銅離子的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)^[2]。

▐  銅的穩(wěn)態(tài)失調(diào)
銅穩(wěn)態(tài)的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂。當(dāng)銅離子因離子載體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過度積累后，一方面，FDX1 將 Cu2+ 還原成更具毒性的 Cu+，抑制線粒體呼吸相關(guān)的鐵硫簇蛋白 (Fe-S Cluster) 的合成，引起蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]。
 
另一方面，FDX1 作為蛋白質(zhì)硫辛酰化修飾的上游調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié) DLAT 的硫辛�；�[1][3]。Cu2+ 可以直接結(jié)合并誘導(dǎo) DLAT 的異聚化，這種不溶性 DLAT 的增加導(dǎo)致細(xì)胞蛋白毒性應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

圖 2. 銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的示意圖^[3]。

 

 
腫瘤治療的戰(zhàn)斗向來困難重重，銅死亡的研究為其提供了一種新的殺死腫瘤的方式。那么如何觸發(fā)銅死亡這一利器為我們所用呢？
總的來說，可以通過提高細(xì)胞內(nèi)游離銅離子濃度，從銅的吸收、輸出和儲(chǔ)存等方面來觸發(fā)銅死亡。銅離子進(jìn)出細(xì)胞由銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SLC31A1 和 ATP7B 控制�？赏ㄟ^：
(1) 過表達(dá) SLC31A1，攝取更多銅離子；
(2) 敲低 ATP7B，減少銅外流，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度；
(3) 利用銅離子載體如 Elesclomol  和 Disulfiram ，將細(xì)胞外 Cu2+ 直接運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)； 
(4) 通過使用丁硫氨酸亞磺酰亞胺(BSO) 消耗內(nèi)源性細(xì)胞內(nèi)銅螯合劑谷胱甘肽 (GSH)，避免 GSH 螯合游離銅離子。

圖 3. 提高細(xì)胞內(nèi)游離銅離子濃度的 4 種方式^[2]。

 
由此，過量的 Cu2+ 或其更具毒性的還原態(tài) Cu2+ 輸入細(xì)胞，通過與硫辛�；�的 DLAT 結(jié)合，進(jìn)一步導(dǎo)致 DLAT 寡聚化。同時(shí)，Cu 還誘導(dǎo) Fe-S 穩(wěn)定性降低或 Npl4-p97 失活，產(chǎn)生專屬銅誘導(dǎo)機(jī)制的細(xì)胞死亡[4]。

當(dāng)然，銅死亡的研究必不可少的便是相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)！其主要包括：
(1) 形態(tài)學(xué)觀測(cè)，如質(zhì)膜破裂，線粒體破裂等；
(2) 相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)，如 Fe-S 簇蛋白 FDX1 和 LIAS 是銅死亡的標(biāo)志，DLAT 和 DLST 的脂酰化的減少和 HSP70 水平增加，產(chǎn)生蛋白毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡；
(3) 代謝指標(biāo)檢測(cè)，如銅離子積累，α-酮戊二酸的積累，以及琥珀酸減少。
表 1. 銅死亡相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)。

NP@ESCu: 一種納米顆粒，包含 Elesclomol, Cu 等。

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▐  (一) 形態(tài)學(xué)檢測(cè)
銅死亡的主要形態(tài)學(xué)表現(xiàn)是線粒體皺縮、細(xì)胞膜破裂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷和染色質(zhì)破裂等[3]。
Guang Zhao 等人在研究銅積累與視網(wǎng)膜發(fā)育畸形和疾病之間關(guān)系時(shí)，測(cè)量了銅過量時(shí)胚胎的形態(tài)學(xué)特征 (圖 4 E)。TEM 分析顯示，銅處理的胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu)被破壞。與對(duì)照組相比，在銅處理視網(wǎng)膜細(xì)胞中，線粒體內(nèi)膜減少并產(chǎn)生大液泡 (E1-E3, 紅色)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成松散結(jié)構(gòu) (E4-E6, 綠色)[12]。

圖 4. 銅處理后對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的 TEM 分析^[12]。

▐  (二) 標(biāo)志物檢測(cè)

研究發(fā)現(xiàn)，銅離子載體 Elesclomol 在心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)銅死亡，其特征是 Fe-S 簇蛋白的減少和線粒體酶脂�；�的減少。
Int J Mol Sci 發(fā)表的 “探究銅死亡對(duì)糖尿病心肌病中 AGEs 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞功能障礙的潛在影響” 中，作者通過 Western Blot 檢測(cè)了 ES-Cu 誘導(dǎo)肌細(xì)胞發(fā)生銅凋亡后的標(biāo)志性變化。

結(jié)果表明，多種線粒體 Fe-S 簇蛋白如 FDX1、LIAS、ACO2、ETFDH 和 NDUFV1 等，均下調(diào)表達(dá) (圖 5A)；DLAT 和 DLST 蛋白質(zhì)脂�；瘻p少 (圖 5B)。此外，作者對(duì)糖尿病 (db/db) 小鼠心肌組織中 Fe-S 簇蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(圖 5C-D)，發(fā)現(xiàn) db/db 小鼠的心臟中 Fe-S 簇蛋白 FDX1、LIAS、NDUFS8 和 ACO2 丟失，且 HSP70 豐度增加[8]。

 

▐  (三) 代謝指標(biāo)檢測(cè)

FDX1 的功能取決于丙酮酸和 α-酮戊二酸積累、避免琥珀酸的消耗，從而保證 PDH 和 α-酮戊二酸脫氫酶的 TCA 循環(huán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)脂肪�；�[1]。Tian 等人利用設(shè)計(jì)了一種納米佐劑 CS/MTO-Cu@AMI，其中包含 MTO 、Cu2+ 和外泌體分泌抑制劑 AMI 等 (圖 6A)。
為了驗(yàn)證銅死亡，作者分析了 HSP 70 和 LIAS 的表達(dá)，并檢測(cè)了三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵代謝物的變化。結(jié)果表明，CS/MTO-Cu@AMI 處理顯著促進(jìn) HSP 70 的表達(dá)，同時(shí)下調(diào) LIAS 的表達(dá) (圖中未顯示)。此外，與對(duì)照組相比，CS/MTO-Cu@AMI 組三羧酸循環(huán)中的丙酮酸和 α-酮戊二酸含量均增加了 40%，而琥珀酸含量下降了 45% (圖 6B-D)，有力地支持 CS/MTO-Cu@AMI 可以有效誘導(dǎo)銅死亡[10]。

圖 6. 不同處理后細(xì)胞的琥珀酸, α-酮戊二酸, 丙酮酸的相對(duì)水平^[10]。

 

 Tips：

納米佐劑 CS/MTO-Cu@AMI：Cu2+ 有效地觸發(fā)銅死亡誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，激活 AMPK 途徑介導(dǎo)的 PD-L1 蛋白降解，剝奪巨噬細(xì)胞和外泌體釋放的能量供應(yīng)，放大細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌滅活的氧化應(yīng)激，從而在體外和體內(nèi)有效地增敏化療并激活全身抗腫瘤免疫。

 

本期小 M 為大家介紹了腫瘤細(xì)胞中銅的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，可從銅的吸收、輸出和儲(chǔ)存等方面采取多種措施提高細(xì)胞內(nèi)游離銅離子濃度，進(jìn)而觸發(fā)銅死亡，與腫瘤發(fā)展做斗爭(zhēng)！此外，小 M 還為大家整理了銅死亡的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)和方法，方便大家的實(shí)驗(yàn)研究~

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Elesclomol (STA-4783) 是一種銅離子載體，能夠特異性結(jié)合鐵氧還蛋白 1 (FDX1) α2/α3 螺旋和 β5 鏈，抑制 FDX1 介導(dǎo)的 Fe-S 簇生物合成，促進(jìn)銅死亡。

Disulfiram 是一種銅離子載體和 ALDH1 抑制劑，對(duì)酒精具有急性敏感性。它可增加細(xì)胞內(nèi) ROS 水平，誘導(dǎo)銅死亡。

Cu(II)GTSM 是一種銅復(fù)合物，具有細(xì)胞通透性。它可顯著抑制 GSK3β、Amyloid-β 寡聚體 (AβOs)，降低 tau 磷酸化。

Penicillamine 是一種重金屬螯合劑，是 Penicillin 的代謝降解產(chǎn)物。它可增加游離銅，增強(qiáng)氧化應(yīng)激。

銅死亡化合物庫 MCE 可以提供 164 種靶向銅死亡相關(guān)靶點(diǎn)及通路的化合物，我們將在明確您的產(chǎn)品用途后，向符合資質(zhì)的客戶通過定制合成服務(wù)的方式提供 MCE 銅死亡化合物庫。MCE 銅死亡化合物庫庫是癌癥、風(fēng)濕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病藥物研究的有用工具。

 
[1] Tsvetkov P, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022 Mar 18;375(6586):1254-1261. 
 
[2] Xie J, et al. Cuproptosis: mechanisms and links with cancers. Mol Cancer. 2023 Mar 7;22(1):46. 
 
[3] Wang Y, et al. Cuproptosis: a new form of programmed cell death. Cell Mol Immunol. 2022 Aug;19(8):867-868. 
 
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[6] Wu H, et al. Copper sulfate-induced endoplasmic reticulum stress promotes hepatic apoptosis by activating CHOP, JNK and caspase-12 signaling pathways. Ecotoxicol Environ Saf. 2020 Mar 15;191:110236. 
 
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[8] Huo S, et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 Signaling Promotes Cuproptosis Induced by Advanced Glycosylation End Products in Diabetic Myocardial Injury. Int J Mol Sci. 2023 Jan 14;24(2):1667. 
 
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[11] Tian H, et al. Clinical Chemotherapeutic Agent Coordinated Copper‐Based Nanoadjuvants for Efficiently Sensitizing Cancer Chemo‐Immunotherapy by Cuproptosis‐Mediated Mitochondrial Metabolic Reprogramming[J]. Advanced Functional Materials, 2023: 2306584. 
 
[12] Zhao G, et al. Copper induce zebrafish retinal developmental defects via triggering stresses and apoptosis. Cell Commun Signal. 2020 Mar 14;18(1):45.