遺傳學(xué)檢測方法之熒光原位雜交與微整列比較基因組雜交的對(duì)比及應(yīng)用

細(xì)胞遺傳學(xué)的檢測分析可以幫助我們了解染色體的變異，進(jìn)而對(duì)相關(guān)疾病更深入的了解。染色體的異�？赡軐�(dǎo)致基因表達(dá)的失調(diào)或產(chǎn)生新的突變蛋白，從而構(gòu)成癌癥、不孕癥和各種先天性疾病(如唐氏綜合征)。非整倍體、缺失、重復(fù)和重排等都屬于染色體異常的類型，再比如基因組拷貝數(shù)變異（copy number variation， CNV），是遺傳病和出生缺陷的重要原因之一。
 

核型分析（Karyotyping）是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究方法，該方法可以用來識(shí)別主要的染色體異常，如單體、多體、染色體重排以及大片段缺失或重復(fù)。然而，該方法受限于低分辨率和較窄的目標(biāo)范圍，因此只能檢測較大的染色體變化(通常為> 5 Mb)。此外，它是一種主觀技術(shù)，因此異常的檢測通常依賴于分析人員的專業(yè)知識(shí)。
 

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）和微整列比較基因組雜交（aCGH）可以對(duì)染色體和基因組結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步的分析，接下來就為大家介紹一下兩種技術(shù)和各自的應(yīng)用：

 

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

FISH是一項(xiàng)分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于檢測和定位細(xì)胞中的DNA序列。該技術(shù)應(yīng)用特異性的熒光標(biāo)記探針與染色體或核酸樣本進(jìn)行雜交，通過熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA或RNA序列的可視化。

實(shí)現(xiàn)FISH技術(shù)主要包括以下的幾步驟：

1.樣本制備階段：提取細(xì)胞或組織樣本，通過固定和制片的過程使樣本處于適合雜交的狀態(tài)。需要根據(jù)不同的樣本類型選擇不同的預(yù)處理方式：

●細(xì)胞或組織的固定

●脫蠟(FFPE組織)

●抗原的修復(fù)

●酶促透化作用

 

2.雜交：將熒光標(biāo)記的DNA/RNA探針加入到制備好的樣本上，并在特定的條件下促進(jìn)探針與目標(biāo)序列的雜交。

 

2.1 Nick Translation自己設(shè)計(jì)RNA/DNA探針

RNA/DNA探針可以選擇自己設(shè)計(jì)和合成，這項(xiàng)技術(shù)稱為Nick Translation（切口平移）主要的操作流程如下：

使用Nick translation DNA Labeling kit(ENZ-GEN111)標(biāo)記TP53 BAC DNA探針的Orange 552 dUTP (ENZ-42842)和著絲粒17 BAC DNA探針的Green 496 dUTP (ENZ-42831)。標(biāo)記探針與中期擴(kuò)散雜交。

 

2.2 即用型DNA/RNA探針

目前市面上有提供很多ready-to-use型的RNA/DNA探針，可直接用于檢測目標(biāo)基因，省去了自己制備的步驟。比如針對(duì)HPV病毒、經(jīng)典的腫瘤靶點(diǎn)（EGFR）、GADPH以及泛素化等等常用病理靶點(diǎn)

 

也有可以同時(shí)檢測四個(gè)不同靶點(diǎn)的探針試劑盒，如下圖所示，是在正常細(xì)胞和染色體異常的細(xì)胞中對(duì)CKDN2A、CEN3、CEN7、CEN17這四種基因（膀胱癌常見變異基因）同時(shí)檢測后的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)CEN3、CEN7、CEN17三種基因在不正常細(xì)胞中數(shù)量有增多

 

3.顯色：

與免疫組化類似，偶聯(lián)了熒光標(biāo)記之后，需要加入顯色劑進(jìn)行后續(xù)的檢測，顯色劑有操作簡便的“一步法”試劑，或當(dāng)樣本豐度較低時(shí)或希望獲得更低背景的結(jié)果時(shí)，有“兩步法”試劑。“兩步法”檢測試劑其實(shí)就是在RNA/DNA探針上偶聯(lián)一個(gè)anti-biotin或anti-digoxin的信號(hào)放大試劑，然后再加入對(duì)應(yīng)的顯色試劑。

Figure. 顯色試劑的兩種檢測方法，一步法（左）兩步法（右）

 

4.檢測：最后通過熒光顯微鏡觀察及攝影，分析熒光信號(hào)的分布和強(qiáng)度，就可以確定目標(biāo)序列的存在與位置。

 

FISH技術(shù)由于其精確性，被廣泛應(yīng)用于以下幾個(gè)領(lǐng)域：

1. 染色體異常檢測：用以檢測染色體結(jié)構(gòu)的畸變，如易位、缺失、復(fù)制及非整倍性等。

2. 基因定位與映射：確定特定基因在染色體上的精確位置。

3. 染色體結(jié)構(gòu)研究：觀察染色體結(jié)構(gòu)變化，及在細(xì)胞周期中的動(dòng)態(tài)變化。

 

FISH技術(shù)有如下的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

1. 高分辨率：FISH能夠在單個(gè)細(xì)胞層面上進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)精確定位。

2. 操作靈活性：可用于多種樣本類型，包括冰凍、石蠟包埋組織及活細(xì)胞。

3. 多色標(biāo)記：可同時(shí)使用多種不同顏色的探針對(duì)多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行檢測。

 

當(dāng)然，F(xiàn)ISH技術(shù)也存在一定的局限性：

1. 對(duì)目標(biāo)序列的依賴性：需要預(yù)先知道目標(biāo)DNA或RNA序列才能設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針。

2. 操作復(fù)雜性：過程較為繁瑣，包括樣本制備、探針制備和信號(hào)檢測等，需要經(jīng)驗(yàn)較豐富的操作人員。

3. 儀器要求：需使用昂貴的熒光顯微鏡，并對(duì)顯微鏡操作有一定要求。

 

微陣列比較基因組雜交（aCGH）技術(shù)

aCGH技術(shù)是檢測與染色體異常相關(guān)的基因拷貝數(shù)增加和拷貝數(shù)丟失的有力工具。與其他技術(shù)(如FISH和G-banding karyotyping)相比，aCGH檢測染色體畸變更快、更穩(wěn)定、結(jié)果更優(yōu)越，從而能夠更好地了解染色體變化在遺傳性疾病和癌癥中的作用。
 

CGH是通過將實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本的DNA用紅綠熒光標(biāo)記之后，然后與芯片進(jìn)行雜交之后，借用專門的數(shù)據(jù)分析軟件檢測紅綠熒光的比值，將兩個(gè)樣本間的DNA拷貝數(shù)變化進(jìn)行比較，最終得出實(shí)驗(yàn)樣本的DNA拷貝數(shù)是減少還是增加。該技術(shù)的具體步驟如下圖所示：

 

Figure. aCGH技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟（圖源來自：10.1007/s10072-016-2658-y）

 

步驟一：抽提樣本的DNA，并分別將對(duì)照樣本和實(shí)驗(yàn)樣本的DNA進(jìn)行黃綠熒光的標(biāo)記

Figure Four replicate 500-ng DNA samples were labeled with Enzo’s CYTAG® CGH Labeling Kit（ENZ-42671）for Oligo Arrays or leading competitor’s kits. Enzo’s proprietary labeling technology generates the highest specific activity of labeling.

 

步驟二：將標(biāo)記之后的DNA混合并與芯片雜交

步驟三：用熒光掃描儀讀取芯片上的熒光信號(hào)

步驟四：通過相關(guān)分析軟件，分析熒光信號(hào)并識(shí)別拷貝數(shù)的增加或減少
 

通過陣列分析軟件計(jì)算熒光的log2比率(Cy5/Cy3)，通過這種方式，可以識(shí)別DNA中的缺失或重復(fù)。與對(duì)照樣本相比，在染色體的特定區(qū)域中，如果實(shí)驗(yàn)樣本顏色的強(qiáng)度較高，表明該區(qū)域的DNA增多，而如果對(duì)照樣本顏色的強(qiáng)度較高，表明該特定區(qū)域的DNA丟失。中性色表示兩個(gè)樣品在此片段無差異，所以是正常狀態(tài)。
 

 

在臨床上，以aCGH技術(shù)和SNP技術(shù)向結(jié)合為基礎(chǔ)的染色體微陣列分析技術(shù)已成功在產(chǎn)前診斷中有所應(yīng)用

Figure. 對(duì)3677名高齡產(chǎn)婦進(jìn)行a-CGH產(chǎn)前診斷，染色體異常在不同高齡孕婦中的具體分布表格，來源：doi: 10.12182/20210160601

 

使用CGH技術(shù)可以測定整個(gè)基因組，且無需細(xì)胞培養(yǎng)；但不能檢測平衡的染色體改變-，且該實(shí)驗(yàn)技術(shù)需要較高質(zhì)量的DNA樣本
 

兩種技術(shù)都為現(xiàn)代遺傳學(xué)研究提供了獨(dú)特的工具，盡管它們?cè)谠�理和�?yīng)用上有所不同，但都是評(píng)估基因組結(jié)構(gòu)變化不可或缺的方法。FISH以其高精度和靈活性在定位染色體的特定區(qū)域上顯得無可替代，而CGH則在全基因組分析方面展現(xiàn)了強(qiáng)大的能力。
 

	FISH	CGH
敏感性	通過使用熒光探針對(duì)特定的基因或染色體區(qū)域進(jìn)行定位，因此在檢測具體基因突變或特定染色體異常方面非常敏感。	CGH適用于檢測DNA全基因組水平的拷貝數(shù)變異（CNV）。雖然它對(duì)拷貝數(shù)改變非常敏感，但沒有FISH那樣可以達(dá)到單個(gè)基因或小片段精度的能力。
特異性	探針設(shè)計(jì)的特異性決定了FISH檢測的準(zhǔn)確度，正確設(shè)計(jì)的探針可以精確標(biāo)記目標(biāo)序列，從而提供高特異性的檢測結(jié)果。	CGH能夠比較樣本整體基因組與參考基因組之間的差異，從而確定拷貝數(shù)增加或減少，但無法提供FISH所提供的確切染色體定位信息。
應(yīng)用類型	1. 單基因或特定染色體區(qū)域的病理研究。 2. 診斷特定的染色體異常，如染色體斷裂和易位。 3. 遺傳性疾病和癌癥中染色體畸形的診斷。	1. 全基因組水平的拷貝數(shù)變異檢測。 2. 腫瘤基因組的全面分析，以發(fā)現(xiàn)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的變異。 3. 檢測整個(gè)基因組的遺傳異質(zhì)性。
技術(shù)選擇建議	若研究需要定量分析特定基因或染色體區(qū)域的變化，F(xiàn)ISH是一個(gè)更好的選擇	若研究關(guān)注于全基因組水平的變化或需要篩查未知的基因變化，CGH能提供更全面的信息

表. FISH技術(shù)和CGH技術(shù)的對(duì)比