化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）方法中磁珠的性質(zhì)與原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）以高靈敏度聞名，可在低濃度下檢測分析物，在寬動態(tài)范圍內(nèi)提供良好檢測限。免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB，簡稱磁珠）具有操作簡便、分離效率高、較大的比表面積及良好的物理穩(wěn)定性的優(yōu)點，是一種性能優(yōu)良的磁性分離載體，是純化、檢測和定量分析復(fù)雜分析物的通用工具。磁珠作為固相載體與CLIA相結(jié)合，在外加磁場的作用下，能夠快速與底物液相分離，磁珠以其高效分離和富集作用在免疫分析反應(yīng)中使抗原對磁珠上固定化抗體的影響顯著降低。
  磁珠作為整個免疫反應(yīng)和信號收集的載體具有顯著優(yōu)越性：
1）磁珠比表面積大，能結(jié)合更多的蛋白分子，可提高檢測范圍。
2）磁珠表面化學(xué)基團與蛋白形成共價偶聯(lián)，相對于物理吸附更牢固，更穩(wěn)定。
3）磁珠均勻懸浮于反應(yīng)溶液中，大大增加與樣本中待測物接觸面積，減少反應(yīng)所需的樣本量，同時更快達到反應(yīng)動態(tài)平衡，加快反應(yīng)速度，節(jié)省反應(yīng)時間。
4）將連有多種捕獲蛋白的磁珠與多標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，實現(xiàn)同一樣本中多個待測物同時檢測，實現(xiàn)全自動個體化檢測。

1. 常見磁珠種類及結(jié)構(gòu)
1.1 種類
1）Carboxyl羧基磁珠
是一種化學(xué)發(fā)光試劑用高性能磁珠，羧基官能團用于蛋白或核酸偶聯(lián)，在酶免測定、免疫沉降、蛋白質(zhì)印記解析時能夠發(fā)揮突出性能。
2）Tosyl甲苯磺�；�磁珠
因涂層中含有甲苯磺�；�所以無需羧合劑，含有氨基的抗體等分子以化學(xué)結(jié)合的方式固定在磁珠表面。隨著化學(xué)結(jié)合的進行，甲苯磺�；鶗�逐漸脫離，粒子表面親水性增強，從而維持磁珠表面偶聯(lián)物生物活性，并可有效抑制分析時的非特異性反應(yīng)。
3）Streptavidin鏈霉親和素磁珠
磁珠偶聯(lián)鏈霉親和素能從樣品中對生物素標(biāo)記的分子進行高純度的特異性吸收。因磁珠表面親水性聚合物涂層不會影響酶促反應(yīng)進行，在PCR反應(yīng)體系中混入磁珠也不會對核酸擴增產(chǎn)生影響。在酶免測定中，還可作為生物素標(biāo)記抗體的載體進行使用。
1.2 結(jié)構(gòu)
磁珠結(jié)構(gòu)一般由磁性內(nèi)核、包裹在外的高分子涂層及功能基層構(gòu)成。在外部磁場作用下，磁珠在磁場中做定向運動，輔以微控制和檢測手段，可實現(xiàn)磁珠定位和介質(zhì)分離。

                                                              磁珠結(jié)構(gòu)

1） 內(nèi)核：主要由純金屬（如鈷、鎳和鐵）或其氧化物等磁性材料組成，此外還可采用CoPt3、FeCo和FePt等磁性材料。
2） 高分子涂層：材料一般為聚苯乙烯、聚氯乙烯，主要用于穩(wěn)定新形成的磁珠表面和防止磁珠聚集。高分子涂層可以與多種活性物質(zhì)結(jié)合，如抗原、抗體、核酸等。
3） 功能基層
蛋白質(zhì)或抗體偶聯(lián)磁珠表面的穩(wěn)定性主要取決于表面性質(zhì)。當(dāng)磁珠表面無修飾時，抗體通過疏水相互作用被動吸附到磁珠表面。這種方式不能控制附著分子的最終方向，也無法保證捕獲分子的特異性和穩(wěn)定性。為確保偶聯(lián)穩(wěn)定性與捕獲特異性，可選擇化學(xué)修飾表面與生物修飾表面。
化學(xué)修飾表面：
①　經(jīng)典化學(xué)修飾表面：抗原或抗體直接被動吸附于化學(xué)修飾磁珠表面�；钚曰鶊F利用磁珠的表面積為抗原或抗體提供大量位點，使其與磁珠共價連接。添加到表面的經(jīng)典基團有羧基、氨基、羥基和硫酸鹽。
Table 1. 磁珠經(jīng)典化學(xué)修飾及活化方式
 

磁珠化學(xué)修飾	活化方式
羧基修飾	添加碳二亞胺（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）或磺基NHS和乙基（二甲氨基丙基）進行活化
氨基修飾	激活蛋白質(zhì)表面羧基
羥基修飾	在非水溶液中活化，以避免中間體水解

②　預(yù)活化修飾表面：分子連接到表面預(yù)活化修飾磁珠之前無需進行初步激活，在適宜緩沖液、pH和溫度條件下即可形成穩(wěn)定共價偶聯(lián)。
Table 2. 磁珠預(yù)活化修飾及結(jié)合基團
 

磁珠預(yù)活化修飾	結(jié)合基團
甲苯磺�；�（Tosyl）修飾	中性pH值：結(jié)合蛋白質(zhì)巰基；偏堿性pH值：結(jié)合氨基。
環(huán)氧基團修飾	pH值稍偏堿性：結(jié)合硫醇基團；較高pH值：結(jié)合氨基；強堿性pH值：結(jié)合含羥基的配體。
氯甲基修飾	室溫中性pH值：結(jié)合氨基

生物修飾表面（表面生物功能化）：
生物功能化磁珠由于其超順磁性被廣泛用于捕獲特定分子或細胞。生物修飾與化學(xué)修飾不同，生物修飾以非共價方式連接分子。在生物技術(shù)領(lǐng)域生物功能化磁珠通常用于蛋白質(zhì)/分子純化等分離過程，在體外診斷試劑中作為固相載體。
①　蛋白A或G以非常高的親和力結(jié)合某些免疫球蛋白亞型。蛋白A結(jié)合大多數(shù)Ig的Fc區(qū)，蛋白G結(jié)合Ig的Fc或Fab區(qū)，可用于固定抗體；
②　鏈霉親和素具有極高親和力，鏈霉親和素與生物素之間的結(jié)合可承受高溫、大范圍pH值等極端條件。
Table 3. 磁珠功能基層對比

功能基層	作用方式	優(yōu)點	缺點
無	磁珠與抗體被動偶聯(lián)	便宜	易出現(xiàn)大量非特異性結(jié)合，產(chǎn)生高背景值
化學(xué)修飾	磁珠通過表面-COOH、-NH2、-OH、-SH等化學(xué)修飾基團與抗體共價偶聯(lián)	表面修飾簡單，偶聯(lián)穩(wěn)定	易出現(xiàn)聚合和非特異性結(jié)合
生物修飾	磁珠通過表面鏈霉親和素、抗IgG、蛋白A或G等生物修飾與抗體非共價偶聯(lián)	生物磁分離，無需額外洗滌；可承受高溫等極端條件	價格昂貴

2. 免疫磁珠作用原理
磁珠一般具有超順磁性，在磁場作用下實現(xiàn)結(jié)合、未結(jié)合蛋白快速分離，簡化操作，縮短反應(yīng)時間。磁珠表面通過外部修飾的功能基團結(jié)合活性蛋白，作為抗原抗體反應(yīng)的載體。磁珠作用方式分為直接作用和間接作用兩種，直接作用是用抗體/抗原包被磁珠直接與特異性抗原/抗體物質(zhì)結(jié)合后，形成磁珠-免疫復(fù)合物。間接作用是用二抗包被磁珠，抗原與一抗進行孵育，再加入二抗偶聯(lián)的磁珠，形成磁珠-二抗-一抗-抗原復(fù)合物。復(fù)合物具有強磁響應(yīng)性，在磁力的作用下定向移動，使復(fù)合物與液體中其他物質(zhì)分離，達到分離、濃縮、純化特異性蛋白的目的。

                                                         磁珠作用原理

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