siRNA構建-腺病毒和慢病毒載體的構建

siRNA載體構建服務程序



1. siRNA表達載體的選用：
本公司選用的siRNA 表達載體含新霉素抗性基因和 GFP 綠色螢光標記，可以建立穩(wěn)定表達系，同時可以實時監(jiān)測載體在細胞中的轉染效率。載體中還含有 Amp 抗性基因，可以無限擴增。

2. 設計 siRNA 靶序列
A 、根據目的mRNA序列，設計3條RNA干擾靶序列，靶序列一般為19 － 21nt 長。

B 、對于每條選定的 siRNA 靶序列，設計 siRNA 正義鏈和反義鏈，以 loop(9nt) 相連，稱為 shRNA（short hairpin RNA ）。
C、陰性對照的設立.

3. 合成模板：
合成每條編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，退火 DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。模板鏈后面接有 RNA PolyIII 聚合酶轉錄中止位點，同時兩端分別設計 BamHI 和 HindIII 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamHI 和 HindIII 酶切位點之間。
4. siRNA 空載體用 BamHI 和 HindIII 雙酶切后， 1 ％瓊脂糖凝膠電泳，回收線性載體。
5. 連接與轉化：
把退火的 DNA 模板雙鏈連接到線性載體中。采用 T4 連接酶，插入片斷與載體的摩爾比約為 3 ： 1 。連接產物轉化 DH5α 大腸桿菌，在 LB Amp 培養(yǎng)基上涂板， 37 ℃ 培養(yǎng)過夜。
6. PCR 鑒定
7. 測序鑒定
8.柱抽提陽性克隆載體并定量。
閃晶生物同時提供腺病毒和慢病毒載體的構建服務,5000.00元/個

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MGB probe      Protein expression    Polyclonal Antibody

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