實時熒光定量PCR技術服務

實時熒光定量PCR（Real Time PCR，qRT-PCR）避免了傳統(tǒng)PCR 以終產(chǎn)物檢測定量
產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重復性。與常規(guī)PCR 相比，實時熒光定量PCR 具有特異
性更強、有效解決PCR 污染問題、自動化程度高等特點，已成為國際公認的核酸分
子定量的標準方法。該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA 表達量的變化；比較不同
組織的mRNA 表達差異；驗證基因芯片，siRNA 干擾的實驗結果。它涉及到DNA
或RNA 樣品制備，反轉錄及PCR 反應等一系列重要的分子生物學過程。

配套產(chǎn)品：qPCR實時熒光定量一步法試劑盒  BK2100BK   BK2100   

 設計目的片段和內(nèi)參基因的qPCR 引物：利用Primer5.0 等軟件設計PCR 引物
及探針。我們公司免費為客戶設計引物和探針。

2 SYBR Green 法：
1）建立以下反應體系
試劑（SYBR Green法） 量
總RNA 根據(jù)實驗
qPCR mix（包含MLV、Hot-start Taq、dNTP等 ） 終濃度為1×
SYBR Green I solution 終濃度為1×
上游引物，10μM 終濃度：~200 nM
下游引物，10μM 終濃度：~200 nM
MgCl2 根據(jù)實驗
RNase-Free H2O To 25.0 μl

2） PCR 反應條件如下：
步驟 循環(huán)數(shù) 步驟溫度 時間
逆轉錄 1 1 42 oC 30 min
失活MLV，激活Taq 1 1 95 oC 10 min
1 95 oC 15 sec
2 X oC* 實時熒光定量PCR 40 30 sec
3 72 oC 30 sec
*與引物的Tm 相關
3） 取5μl PCR 產(chǎn)物跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳，或做溶解曲線，檢測PCR 產(chǎn)物的
特異

                                                                      熒光圖譜                                                             

2 Taqman 法
1） 建立以下反應體系
試劑（Taqman法） 量
總RNA 根據(jù)實驗
qPCR mix（包含MLV，Hot-start Taq、dNTP
等 ）
終濃度為1×
Taqman Probe 根據(jù)實驗
上游引物，10μM 終濃度：~200 nM
下游引物，10μM 終濃度：~200 nM
MgCl2 根據(jù)實驗
RNase-Free H2O To 25.0 μl

2） PCR 反應條件如下：
步驟 循環(huán)數(shù) 步驟溫度 時間
逆轉錄 1 1 42 oC 30 min
失活MLV，激活Taq 1 1 95 oC 10 min
1 95 oC 15 sec
實時熒光定量PCR 40
2 60 oC* 1 min
3實驗完畢之后，將數(shù)據(jù)導入到Excel 中進行數(shù)據(jù)分析。
4.結果分析：
利用ΔΔCt 法，相對定量，將目的基因的表達與看家基因的表達對比，獲得沉默
效果。如下圖所示：