Tet誘導(dǎo)表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)

Tet誘導(dǎo)表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù) 　　目前，已經(jīng)研究開發(fā)出了多種Tet調(diào)控表達(dá)載體系統(tǒng)，主要分為Tet-on系統(tǒng)和Tet-off系統(tǒng)。在進(jìn)行基因功能研究中，多用Tet-on系統(tǒng)，而Tet-off系統(tǒng)基本棄用。 　　百恩維生物能為您提供Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的載體構(gòu)建服務(wù)，并且有多種表達(dá)載體供您選擇： 1、常規(guī)的真核表達(dá)的兩質(zhì)粒Tet-on系統(tǒng)。 2、百恩維生物自主開發(fā)的病毒（慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒）單質(zhì)粒Tet-on系統(tǒng)，構(gòu)建好的質(zhì)粒可直接用于真核表達(dá)，也可包裝相應(yīng)的病毒后使用，感染效率更高，目標(biāo)基因誘導(dǎo)表達(dá)水平更強(qiáng)。 3、病毒單質(zhì)粒Tet-on系統(tǒng)不僅可以表達(dá)目標(biāo)基因，也可用于表達(dá)ShRNA。 4、百恩維生物自主開發(fā)的病毒單質(zhì)粒Tet-on系統(tǒng)，含有GFP標(biāo)記基因、藥篩標(biāo)記（Neomycin、Puromycin），可用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。 　　　　 ★ Tet誘導(dǎo)表達(dá)原理 　　四環(huán)素（Tet）誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的基本原理是由誘導(dǎo)藥物（如Tet）改變調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而控制目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。最初的Tet誘導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)是以大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子上Tet抗性操縱子為基礎(chǔ)而建立的。Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)與Tet操縱基因(Tet operator, TetO)DNA序列有特異的親和能力，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無Tet存在時，TetR會與TetO結(jié)合，從而阻斷下游的抗性基因表達(dá)。當(dāng)有Tet存在時，藥物使TetR的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致TetR與TetO分離，從而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表達(dá)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。 　　利用TetR和TetO特異結(jié)合的特性，目前開發(fā)改造了多種類型的Tet調(diào)控表達(dá)載體系統(tǒng)，但根據(jù)其表達(dá)特點(diǎn)可以歸為兩大類：抑制型系統(tǒng)Tet-off和激活型系統(tǒng)Tet-on。 　　　 　　Tet-off調(diào)控系統(tǒng) 　　最早的Tet-off基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)由調(diào)節(jié)表達(dá)載體和反應(yīng)表達(dá)載體組成。調(diào)節(jié)表達(dá)載體包含一個由人巨細(xì)胞病毒早期啟動子(PhCMV)啟動Tet轉(zhuǎn)錄活化因子(tetracycline transcrip-tional activator, tTA)，tTA由TetR與單純皰疹病毒(HSV)VP16蛋白質(zhì)C端的一段轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合而成。反應(yīng)表達(dá)載體由Tet應(yīng)答元件(Tet-responsive element, TRE)、最小CMV啟動子(minimal CMV promoter, Pmin CMV)及目的基因組成。目的基因位于TRE和PminCMV的下游；TRE為7次重復(fù)的TetO序列。PminCMV缺失增強(qiáng)子，因此在tTA未結(jié)合到TRE時，目的基因不表達(dá)；相反，當(dāng)tTA結(jié)合到TRE時，VP16會使PminCMV活化從而使基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無Tet或其衍生物強(qiáng)力霉素(doxcycline, Dox)的存在時，tTA可與TRE結(jié)合，打開基因表達(dá)；而當(dāng)Tet或Dox存在時，它們可使tTA中的TetR改變構(gòu)象，則tTA將從TRE上脫落下來，使TRE中的PminCMV處于非激活狀態(tài)，從而使基因表達(dá)處于關(guān)閉狀態(tài)。 Tet-on調(diào)控系統(tǒng) 　　Tet-on調(diào)控系統(tǒng)與Tet-off調(diào)控系統(tǒng)的區(qū)別在于其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)為反義Tet轉(zhuǎn)錄活化因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator, rtTA)。rtTA是由反義TetR(reverse TetR, rTetR)與VP16的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域融合而成。rTetR由TetR中的4個氨基酸發(fā)生突變而衍生而來的。rTetR的表型與TetR相反，在無Dox時，其不能結(jié)合TRE，導(dǎo)致基因表達(dá)關(guān)閉；而在有Dox存在時，其會結(jié)合在TRE上，導(dǎo)致基因表達(dá)開放。（詳見圖4） 　　 　　Tet誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 具有低本底與高誘導(dǎo)倍數(shù)的特點(diǎn)，無誘導(dǎo)時目的基因表達(dá)水平低，誘導(dǎo)時其表達(dá)水平增高，最高誘導(dǎo)倍數(shù)可達(dá)10,000倍。 誘導(dǎo)所需的時間短，Dox為脂溶性，容易滲透細(xì)胞和組織，在加入誘導(dǎo)劑30分鐘內(nèi)即可檢測到目的基因的表達(dá)。 該誘導(dǎo)系統(tǒng)是一種可逆系統(tǒng)，當(dāng)去除誘導(dǎo)劑一定時間后可使該系統(tǒng)關(guān)閉，之后仍可通過加入誘導(dǎo)劑重新開啟。 誘導(dǎo)藥物為Tet或其衍生物(如Dox)，安全。Tet作為一種抗生素已被人們應(yīng)用了很長時間，已被廣泛作為抗生素使用，是對人體較為安全的一種藥物。 Tet誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用 　　Tet系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于動物體內(nèi)和體外（細(xì)胞水平）基因功能、蛋白質(zhì)功能、以及mRNA功能的研究，也用于體外基因治療的研究。 　　 比如該系統(tǒng)已成功的用于胰島細(xì)胞、肺組織、腦組織以及帕金森病、軟骨病等基因治療實(shí)驗(yàn)研究中，目前該系統(tǒng)也用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced luripotent stem cell, iPS cell)技術(shù)中的重編程因子表達(dá)的調(diào)控。 相關(guān)技術(shù)服務(wù) 基因過表達(dá)載體構(gòu)建 microRNA表達(dá)載體構(gòu)建 shRNA表達(dá)載體構(gòu)建