細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù) 天津賽爾生物

真核細胞轉(zhuǎn)染及篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系
天津賽爾生物可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的并且表達某種蛋白的克隆細胞服務(wù) 1、 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 原理：將需轉(zhuǎn)移的 DNA 或 RNA 包裹于脂質(zhì)體，通過脂質(zhì)體與細胞膜的融合將 DNA 或 RNA 轉(zhuǎn)入宿主細胞內(nèi)。 因此，細胞膜通透性高的細胞，脂質(zhì)體復(fù)合物較易進入，轉(zhuǎn)染效率較高；而有的細胞系本身就不容易被轉(zhuǎn)染。 2、 電穿孔轉(zhuǎn)染 原理：電流能可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使 DNA 分子進入胞內(nèi)。優(yōu)勢：細胞范圍廣，無論懸浮細胞還是貼壁細胞，均能被有效轉(zhuǎn)染。缺點：高電場強度會對細胞具有較強的殺傷效應(yīng)。 目前本公司正在引進更為先進的電穿孔儀，能夠有效減輕對細胞的殺傷作用。 3 、腺病毒感染 對于脂質(zhì)體和電穿孔都無法轉(zhuǎn)染的細胞，可采用腺病毒感染的方式進行目的分子的導(dǎo)入。優(yōu)點：感染效率高。缺點：只能瞬時表達。 服務(wù)內(nèi)容： 一、確認細胞對質(zhì)粒載體或腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率 二、轉(zhuǎn)染攜帶目的基因的質(zhì)粒載體， G418 篩選（或流式細胞分選）后建立穩(wěn)定表達細胞株 三、對攜帶目的基因的載體（質(zhì)粒載體或腺病毒載體）進行相關(guān)檢測實驗 具體操作： 一、細胞轉(zhuǎn)染效率的確定： 1 、將目的細胞以合適的數(shù)目接種于 24 孔板中（一般為 1 × 105 細胞 / 孔）； 2 、第二天轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體（攜帶報告基因 EGFP ）：采用的脂質(zhì)體購自 Invitrogen 公司； 或感染攜帶報告基因 EGFP 的腺病毒載體； 3 、感染后 48h 流式細胞檢測 EGFP 的表達，明確其轉(zhuǎn)染或感染效率； （攜帶報告基因 EGFP 的載體可由本公司提供） 二、穩(wěn)定表達細胞株的建立 1 、將轉(zhuǎn)染后的細胞按照一定的比例接種到 6 孔板中（一般選用 1 ： 10 和 1 ： 100 兩個梯度），分別采用 1200 m g/ml ， 1000 m g/ml 和 800 m g/ml 的 G418 進行篩選； 以轉(zhuǎn)染攜帶 EGFP 質(zhì)粒載體的細胞作為陽性對照，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的細胞作為陰性對照； 2 、每 3 ～ 4 天換液一次； 3 、篩選 20 ～ 30 天，即可得到穩(wěn)定表達細胞株； 4 、傳代后，以一定的 G418 濃度維持培養(yǎng)； 三、對攜帶目的基因的載體（質(zhì)粒載體或腺病毒載體）進行相關(guān)檢測實驗 檢測項目： （一）蛋白表達的檢測 1 、流式細胞檢測膜蛋白的表達； 2 、 ELISA 檢測分泌型蛋白的表達； 3 、 Western-blot 檢測其他蛋白的表達； （二）細胞凋亡檢測（流式細胞檢測） （三）細胞增殖檢測（ MTT 法或 CCK8 法） （四）細胞遷移檢測 （五）信號通路研究（ Western-blot 或 Real-time ） 客戶須知： 1．一般情況下細胞的轉(zhuǎn)染效率達到50%，我們才可以成功進行后續(xù)檢測實驗。如果在25%-40%，可以進行G418瞬時篩選，低于25%也可以做G418的穩(wěn)定篩選，大部分情況下我們都會建議用大流式細胞儀進行篩選，此方法既快速又方便，而且可以得到100%的陽性細胞，一般經(jīng)過大流式篩選的細胞做后續(xù)基因水平或蛋白水平檢測都可以得到理想的結(jié)果。 2．客戶需提供高效率毒性低的轉(zhuǎn)染試劑（質(zhì)脂體）或購買我們公司代理的德國Biontex公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（此試劑轉(zhuǎn)染效率中上等優(yōu)點是毒性低） 3．如客戶提供細胞系轉(zhuǎn)染效率達到50%，我們可以順利快速進行實驗，約1－2個工作日就可完成此實驗。如客戶提供細胞系轉(zhuǎn)染效率低于50％，我們就要進行1－2個工作日的 G418的篩選實驗，轉(zhuǎn)染效率低于25％，無論做G418的穩(wěn)定篩選還是大流式篩選實驗時間都將推后2－3個工作日。

賽爾生物相關(guān)服務(wù)： MicroRNA相關(guān)服務(wù) siRNA干擾 課題整體外包服務(wù) 基因克隆服務(wù) 慢病毒包裝服務(wù) 腺病毒服務(wù) 穩(wěn)定細胞株篩選服務(wù) 蛋白表達服務(wù) 抗體制備服務(wù) DNA與蛋白相互作用研究 噬菌體展示技術(shù)服務(wù) cDNA文庫構(gòu)建 干細胞研究 基金申請，標書撰寫，專利申請，課題設(shè)計等 聯(lián)系。
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