用熒光素酶基因標記腫瘤細胞

哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個氨基酸構成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。將標記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強度與標記細胞的數(shù)目線性相關。

我們采用慢病毒表達系統(tǒng)GFP（mCherry）和Luciferase2雙標記表達細胞系，通過2A序列連接GFP（mCherry）和Luciferase2，可同時等量表達GFP（mCherry）和Luciferase2，便于體外觀察和體內(nèi)示蹤；mCherry可用于體內(nèi)示蹤，與新一代Luciferase2結合，可方便的監(jiān)測細胞在體內(nèi)的生長和變化。

轉(zhuǎn)染方法與標記過程的描述（慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選）： 

1. 質(zhì)粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳， TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。

6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時后換培養(yǎng)液。

8.報告基因檢測：Passive Lysis Agent裂解細胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。

9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。

1. 慢病毒包裝部分

1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞：轉(zhuǎn)染前一天， 293T在10cm培養(yǎng)盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時，細胞在培養(yǎng)盤中密度達到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。

2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。

1. 慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化目的細胞并計數(shù)，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度），37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl完全培養(yǎng)基。

5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。

維持培養(yǎng)。

7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。

8. 目的細胞-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×10⁴細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。