SILAC-IP免疫共沉淀—SILAC技術(shù)的蛋白質(zhì)相互作用

服務(wù)簡(jiǎn)介-輝駿生物
不同的同位素培養(yǎng)基分別培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，達(dá)到體內(nèi)標(biāo)記的目的。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)，依靠抗原與抗體之間的專一性反應(yīng)分離得到免疫復(fù)合物；之后，利用LC-MS/MS來(lái)定性和定量免疫復(fù)合物中的蛋白：當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中某個(gè)蛋白質(zhì)的含量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)，判定這個(gè)蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)-輝駿生物
1、特異性強(qiáng)，結(jié)果可信，假陽(yáng)性極低；
2、靈敏度高，樣本需求量少；
3、高通量，能一次性檢測(cè)到多種互作蛋白；
4、能直接檢測(cè)出與bait蛋白互作的其它蛋白的相對(duì)含量

服務(wù)內(nèi)容-輝駿生物
1、細(xì)胞同位素標(biāo)記          
2、蛋白提取、免疫沉淀；    
3、蛋白分離
4、液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)
5、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和定性、定量分析 
6、相互作用蛋白的生物信息學(xué)分析              

技術(shù)應(yīng)用-輝駿生物
3.5.1野生型細(xì)胞系
1、分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)2組相同的野生型細(xì)胞，培養(yǎng)至第5~6代時(shí)做標(biāo)記測(cè)試；
2、待標(biāo)記完全后，取等量的2組細(xì)胞提取蛋白質(zhì)；
3、提取的輕鏈、重鏈細(xì)胞總蛋白分別用Normal IgG和抗誘餌蛋白的特異性抗體做免疫共沉淀（Co-IP）；
4、混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物，SDS-PAGE分離；
5、膠內(nèi)酶切，肽段抽提、純化；
6、LC-MS/MS定性和定量免疫復(fù)合物中的蛋白質(zhì)

3.5.2基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞系
1、構(gòu)建興趣基因(帶標(biāo)簽)的過(guò)表達(dá)細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系；
2、分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)上述2組細(xì)胞系，培養(yǎng)至第5~6代時(shí)做標(biāo)記測(cè)試；
3、待標(biāo)記完全后，取等量的2組細(xì)胞混合并提取蛋白質(zhì)；
4、輕、重鏈蛋白混合物用標(biāo)簽蛋白的抗體做Co-IP；
5、（1）若抗體和磁珠非化學(xué)偶聯(lián)，Co-IP洗脫液中常有抗體干擾，需要用SDS-PAGE膠分離的方法先去除抗體輕、重鏈，之后做蛋白條帶的膠內(nèi)酶切并抽提肽段；
   （2）若抗體和磁珠已化學(xué)偶聯(lián)，做SDS-PAGE確認(rèn)是否無(wú)抗體干擾；在確保無(wú)干擾的情況下，進(jìn)行溶液內(nèi)酶切，之后做LC將肽段混合物分為多個(gè)組分；
6、膠內(nèi)酶切的肽段組分或一維LC分離的肽段組分再經(jīng)LC-MS/MS，得到免疫復(fù)合物中蛋白質(zhì)的定性和定量信息。

3.5.3基因干擾細(xì)胞系
1、構(gòu)建興趣基因的干擾細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系；
2、分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)上述2組細(xì)胞系，培養(yǎng)至第5~6代時(shí)做標(biāo)記測(cè)試；
3、待標(biāo)記完全后，取等量的2組細(xì)胞混合并提取蛋白質(zhì)；
4、輕、重鏈蛋白混合物用興趣蛋白的抗體做Co-IP；
5、同上，亦可采用2種方法：
（1） SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)、膠內(nèi)酶切；
（2） 溶液內(nèi)酶切、LC分離肽段；
6、肽段再經(jīng)LC-MS/MS，得到免疫復(fù)合物中蛋白質(zhì)的定性和定量信息。

客戶須知-輝駿生物

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