DNA甲基化檢測(cè)

 概念和原理：

    DNA甲基化是基因表觀修t幣方式之一。在人類的表觀遺傳學(xué)研究中，最常見的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修飾。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。亞硫酸氫鹽反應(yīng)能夠使DNA片段中未甲基化的C與亞硫酸氫鈉發(fā)生反應(yīng)，C變成U，經(jīng)PCR擴(kuò)增，U變丁，而甲基化的C不發(fā)生反應(yīng)，保持不變，從而與未甲基化的C區(qū)別開來(lái)。目前王要的研究方法也是基于亞硫酸氫鹽的處理。本公司提供的甲基化檢測(cè)有MSP、BSP和HRM方法。

l 甲基化特異性的PCR( methylation-specific PCR，MSP)

    MSP是Herman等(1996)在使用亞硫酸氫鹽處理的基礎(chǔ)上建立的一種方法。該方法在甲基化區(qū)域設(shè)計(jì)甲基化特異性的引物對(duì)(MPrimers)和非甲基化的引物對(duì)(U Primers)，使用M Primers和U Primers進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測(cè)此MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果使用MPrimers能擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化；若用U Primers擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。該方法是一種簡(jiǎn)便的、特異的、敏感的檢測(cè)單基因甲基化的方法，可用于高通量樣品基兇特異位點(diǎn)甲墾化的檢測(cè)。

l 直接測(cè)序法( bisulfite sequencing PCR．BSP)

    BSP法是Frommer等(1992)提出的DNA甲基化研究方法。該方法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的C脫氨基轉(zhuǎn)變成U，而甲基化的C保持不變，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需片段，則U全部轉(zhuǎn)化成T。最后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。該方法是是目前新甲基化位點(diǎn)的尋找和基因特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)最可靠方法之一。但該方法需要大量的克隆測(cè)序，過程較為繁瑣、昂貴。

l 高分辨率熔解曲線分析技術(shù)( high resolution melting．HRM)

HRM是近年來(lái)興起的一種甲基化檢測(cè)的新方法。基本原理是在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽處理后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的C經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成T．而甲基化的C不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。

科研和臨床應(yīng)用

l 腫瘤的早期預(yù)測(cè)、分類分級(jí)、預(yù)后評(píng)估及多種疾病的分析。

l 轉(zhuǎn)錄水平分析：位于啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化一般會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄。

l 細(xì)胞凋亡等調(diào)控機(jī)制的研究。

標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸

l DNA樣品，如需長(zhǎng)途運(yùn)輸，可將檢測(cè)合格的樣品編號(hào)密封，注意切勿泄漏，冷凍運(yùn)輸。

l 組織和細(xì)胞樣品，采樣后立即用液氮速凍，于-80℃保存，冷凍運(yùn)輸。

l 血液樣品：新鮮全血EDTA抗凝或枸椽酸鈉抗凝，2-8℃48 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，如不能立即運(yùn)送，樣品采集后于-20℃或-80℃保存，冷凍運(yùn)輸。

客戶須知

l 細(xì)胞（≥1×IOn個(gè)）、組織(≥300 mg)、血液(≥1 ml)、血清(≥1.5 ml)等樣品，基因組DNA（體積≥20川，；農(nóng)度≥50 rigMI，用ddH20溶解DNA）。

l 客戶需提供檢測(cè)目的基因的名稱、序列或者Genbank序列號(hào)。

報(bào)告形式

報(bào)告單包括：檢測(cè)方法、檢測(cè)結(jié)果（MSP電泳圖片、BSP測(cè)序結(jié)果或HRM熔解曲線）、檢測(cè)結(jié)果解釋（檢測(cè)區(qū)域是否發(fā)生甲基化），如下：

檢測(cè)方法：MSP法

檢測(cè)結(jié)果：2%瓊脂糖凝膠電泳圖