糖譜檢測

——即蛋白質(zhì)藥物的糖型分析技術服務

糖基化在生物系統(tǒng)中重要功能，準確鑒定蛋白質(zhì)多肽類藥物的糖基化情況是蛋白藥物監(jiān)管指導原則中的一部分。相對分子質(zhì)量作為蛋白質(zhì)樣品的主要特征參數(shù)之一，是確定一種新型蛋白、進行蛋白質(zhì)后續(xù)研究活動的重要前提。

隨著現(xiàn)代分析技術的發(fā)展，特別是高分辨質(zhì)譜技術——高分辨的準確質(zhì)量數(shù)（HR/AM）Orbitrap質(zhì)譜能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)相對分子量的測定。APT通過分別測定脫糖前后樣品的分子量，其差值即為糖鏈的分子量，進而根據(jù)分子量推測其糖型。

“抗體類蛋白質(zhì)藥物的糖型定性定量分析是質(zhì)控分析中的重要組成部分”

技術指標

APT糖型分析的樣品純度在99%以上，脫糖由PNGaseF酶處理，樣品由Q Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進行質(zhì)譜分析。分析時長：20min；檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：1000-4000m/z；一級質(zhì)譜分辨率：17500；AGC target：3e6；In-source CID：45eV；Maximum IT：250ms。

技術原理

糖基化對蛋白的生物活性至關重要，因此，需要對多批次抗體的糖基化形式都進行表征，檢測其糖基化形式的變化范圍，之后證明該單抗藥物的糖型結構在參照糖型的變化范圍內(nèi)�？贵w糖基化修飾的表征分為3個層面：全抗體糖型分析、糖基化位點分析、寡糖鏈分析。

利用高分辨率分子量測定對全抗體糖型進行分析時，是根據(jù)脫糖前后蛋白質(zhì)的高分辨率分子量結果，可以計算出其糖鏈的分子量。與抗體類蛋白質(zhì)藥物常見的一些糖基化修飾相對照，可以確定其糖型。從去卷積后的分子量圖譜中和質(zhì)譜峰面積可以獲得相應的糖型以及比例關系。

幾種常見的抗體糖基化修飾

案例分析

下面兩幅圖譜分別表示樣品脫糖前、后的相對分子質(zhì)量。

圖為糖型分析中脫糖前的高分辨率質(zhì)譜計算出的相對分子質(zhì)量

圖為糖型分析中脫糖后的高分辨率質(zhì)譜計算出的相對分子質(zhì)量

該項目原始數(shù)據(jù)由Protein Deconvolution Version 1.0 (Thermo)軟件處理，采用ReSpectTM算法。參數(shù)設置：Charge Carrier：H+；Noise Rejection：95% confidence；Target Mass：150000；Minimum Adjacent Charges：15；Mass Tolerance：0.05Da。

樣品分別測定脫糖前后的分子量，差值即為糖鏈的分子量，進而根據(jù)分子量推測其糖型。根據(jù)圖譜中樣品脫糖前后分子量的差異得出樣品中3種主要糖鏈的分子量：2891.40 Da，3054.94 Da，3213.96 Da。通過樣品所含糖鏈的實測分子量與幾種類型N-糖的理論分子量進行匹配后發(fā)現(xiàn)，G0F/ G0F、G0F/ G1F、G1F/ G1F三種N-糖的分子量與實測分子量非常接近，與單克隆抗體所具有的N-糖類型相符。3種糖鏈分子量差值分別為163.5 Da和159.0 Da，根據(jù)已知的糖型可知3種糖鏈之間相差一個半乳糖。

用質(zhì)譜峰面積（Protein Deconvolution 1.0）計算3種糖型的分子量，結果為G0F/ G0F : G0F/ G1F : G1F/ G1F=X : X : X。

Q&A

1)   糖型的定性分析和高分辨率分子量測定之間的關系。

糖基化對蛋白的生物活性至關重要，因此，需要對多批次抗體的糖基化形式進行表征，檢測其糖基化形式的變化范圍。之后證明該單抗藥物的糖型結構在參照的糖型的變化范圍內(nèi)�？贵w糖基化修飾的表征分為3個層面：全抗體糖型分析、糖基化位點分析、寡糖鏈分析。我們是采用高分辨率分子量測定對全抗體糖型進行分析。

2)   脫糖前后的糖基化蛋白質(zhì)高精度分子量分析方法。

根據(jù)脫糖前后蛋白質(zhì)的高分辨率分子量結果，可以計算出其糖鏈的分子量。與抗體類蛋白質(zhì)藥物常見的一些糖基化修飾相對照，可以確定其糖型。從去卷積后的分子量圖譜中和質(zhì)譜峰面積可以獲得相應的糖型以及比例關系。