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細(xì)胞增殖/細(xì)胞克隆形成/細(xì)胞遷移//細(xì)胞侵襲/細(xì)胞凋亡/細(xì)胞周期
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細(xì)胞培養(yǎng)和處理
細(xì)胞培養(yǎng)
常規(guī)細(xì)胞2D培養(yǎng)、3D培養(yǎng)及細(xì)胞共培養(yǎng)。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染
包括質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、siRNA轉(zhuǎn)染等。并可以結(jié)合qPCR和Western Blot實驗對轉(zhuǎn)染后相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定，后續(xù)可以對轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能檢測。
細(xì)胞藥物處理
確定藥物或化合物的IC50濃度及作用時間。
細(xì)胞培養(yǎng)
常規(guī)細(xì)胞2D培養(yǎng)、3D培養(yǎng)及細(xì)胞共培養(yǎng)。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染
包括質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、siRNA轉(zhuǎn)染等。并可以結(jié)合qPCR和Western Blot實驗對轉(zhuǎn)染后相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定，后續(xù)可以對轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能檢測。
細(xì)胞藥物處理
確定藥物或化合物的IC50濃度及作用時間。
細(xì)胞功能
細(xì)胞增殖
· CCK8法
CCK8法原理是WST-8四唑鹽（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）能被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原成橙色甲臜染料，然后測定450 nm下的吸光值，生成的甲臜的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。CCK8法可以做6天左右的生長曲線，1-6天每天收取細(xì)胞樣本檢測。也可以類似MTT法，在相同時間比較不同處理組。
· EdU法
EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶插入正在復(fù)制的DNA中。EdU與熒光染料可以特異性地反應(yīng)檢測DNA的復(fù)制。
細(xì)胞克隆形成
細(xì)胞克隆形成實驗是用來檢測細(xì)胞增殖能力、侵襲性、對殺傷因素敏感性等的重要技術(shù)方法。當(dāng)單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。每個克隆含有50以上的細(xì)胞，大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨立生存能力。各種理化因素可能導(dǎo)致細(xì)胞的克隆形成能力發(fā)生改變。通過一定的實驗方法可以對細(xì)胞的克隆形成能力進(jìn)行檢測，細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。
細(xì)胞遷移
· Transwell檢測
細(xì)胞遷移是指細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。細(xì)胞遷移為細(xì)胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細(xì)胞體尾部收縮在時空上的交替過程。細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的基本功能之一，是機體正常生長發(fā)育的生理過程，也是活細(xì)胞普遍存在的一種運動形式。
Transwell的基本原理是將transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液。將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運動等的影響。
細(xì)胞侵襲
· Transwell檢測
細(xì)胞侵襲是指細(xì)胞向局部侵犯，細(xì)胞侵襲實驗可用來研究細(xì)胞和胞外基質(zhì)之間的相互作用。胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供了結(jié)構(gòu)支架，同時也包含了許多細(xì)胞生存及生長過程中生物功能因子。細(xì)胞可以分泌酶，用于降解胞外基質(zhì)中特定的組分，從而使細(xì)胞可以在細(xì)胞間質(zhì)中移動。胞外基質(zhì)膠模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)胞外基質(zhì)環(huán)境，包含了支撐細(xì)胞結(jié)構(gòu)的最基本的組分。轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞由于其高遷移和/或降解胞外基質(zhì)的酶活從而表現(xiàn)出較強的侵襲性。
鋪有Matrigel膠的Transwell小室可用于檢測細(xì)胞侵襲能力。 Transwell的基本原理是將transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以鋪有 Matrigel 膠聚碳酸酯膜相隔，Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8μm，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以細(xì)胞小室上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運動。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。
細(xì)胞凋亡
· Annexin V-PI雙染色流式檢測
在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，通過流式細(xì)胞儀檢測可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。
細(xì)胞周期
· PI( 碘化丙啶）染色
細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 期 )。由于細(xì)胞周期各時相的 DNA 含量不同，通常正常細(xì)胞的 G1 / G0 期具有二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結(jié)合，其熒光強度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀 PI 染色法對細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進(jìn)行檢測時，可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為 G1 / G0期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細(xì)胞百分率。
細(xì)胞分泌物檢測
單核細(xì)胞、免疫細(xì)胞等的TNF和IL定量測定（采用ELISA方法進(jìn)行檢測），在與炎癥相關(guān)的藥物篩選研發(fā)中運用的相當(dāng)廣泛。
細(xì)胞基因、蛋白水平檢測
qPCR、ddPCR、Western Blot（digital Western Blot）等。
CRISPR/Cas9基因修飾
基因敲除：基因上產(chǎn)生DSB，在非同源末端連接修復(fù)過程中會產(chǎn)生DNA的插入或刪除，從而造成移碼突變。
突變引入：用含有特異突變的同源模板，位點產(chǎn)生DSB提高重組效率，從而實現(xiàn)特異突變的引入。
定點轉(zhuǎn)基因：同源模板中加入轉(zhuǎn)基因，在DSB修復(fù)過程中拷貝至基因組中，從而實現(xiàn)定點轉(zhuǎn)基因。
常見問題
細(xì)胞功能研究平臺--樣本準(zhǔn)備
客戶細(xì)胞樣本
1、進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，需告知細(xì)胞名稱、培養(yǎng)條件等信息。
2、客戶提供的可直接進(jìn)行實驗的細(xì)胞，需保證細(xì)胞質(zhì)量，如沒有細(xì)菌、真菌、支原體等感染；并保證細(xì)胞的生長狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)以我公司技術(shù)人員收到細(xì)胞后的觀察狀態(tài)為準(zhǔn)；具體實驗所需的細(xì)胞量可根據(jù)實驗咨詢技術(shù)人員；流式檢測樣品需提供熒光信息。
3、寄送凍存細(xì)胞需用液氮或者干冰保存運輸。
4、寄送培養(yǎng)細(xì)胞需裝滿培養(yǎng)基，擰緊培養(yǎng)瓶蓋，封好封口膜，常溫運輸，嚴(yán)禁冰凍。
客戶提供實驗中的相關(guān)試劑
1、提供廠家貨號、保質(zhì)期、保存條件等信息。
2、客戶配制的試劑需提供名稱、濃度、安全性、保存條件等信息。
3、請告知具體的實驗方案中涉及的實驗試劑的具體用量與用法。
客戶提供組織或血液進(jìn)行細(xì)胞分離：
1、組織分離需提前告知，并預(yù)約時間。
2、組織樣本只能在4℃條件保存或運輸，有條件可以加入組織保存液、嚴(yán)禁冰凍。
3、需提供足夠的組織量。
4、分離方法及要求需提供說明。
5、血液樣本需用抗凝管保存。
6、提供的血樣或者組織需提供來源說明（特別是病人組織，暫不能接受具傳染性的樣本）。
細(xì)胞功能研究平臺--常見問題
Q：需要提供細(xì)胞功能實驗的具體實驗步驟嗎？
A：如是細(xì)胞毒性實驗，Transwell實驗等常規(guī)實驗，不需要提供具體實驗步驟；如涉及特殊的實驗，或者常規(guī)實驗中實驗條件有特殊要求的，則需要提供具體實驗步驟。
Q：購買細(xì)胞收到后如何處理？
A：常溫運輸?shù)募?xì)胞：通常是復(fù)蘇后生長至對數(shù)期的細(xì)胞。首先觀察包裝是否完好，瓶口是否漏液，然后顯微鏡拍攝40x、100x、200x不同倍數(shù)的照片各兩張。放入培養(yǎng)箱穩(wěn)定兩小時后方可進(jìn)行其他操作。貼壁細(xì)胞把培養(yǎng)基全部吸去，加入10mL新的完全培養(yǎng)基；懸浮細(xì)胞離心后把培養(yǎng)基全部吸去，用10mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
低溫運輸?shù)募?xì)胞：通常是用干冰寄送的凍存細(xì)胞�？蛻羰盏郊�(xì)胞后，觀察干冰是否揮發(fā)，細(xì)胞是否溶解。若無其他問題，推薦當(dāng)天復(fù)蘇，亦可直接放入液氮罐保存（長時間），或者超低溫冰箱（不超過一周）。收到細(xì)胞復(fù)蘇后如細(xì)胞狀態(tài)不佳或培養(yǎng)中遇到問題，需當(dāng)天盡快聯(lián)系我方，并拍攝40x、100x、200x不同倍數(shù)的圖片，以便售后處理。7天內(nèi)反饋細(xì)胞本身問題免費重發(fā)，如操作原因?qū)е驴筛鶕?jù)實際情況酌情處理；7天內(nèi)未接到任何反饋視為合格，不予免費售后。
Q：細(xì)胞株轉(zhuǎn)染時的瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)區(qū)別是什么？
A： 瞬轉(zhuǎn)即瞬時轉(zhuǎn)染，是指將外源質(zhì)粒通過某種方式導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)；
穩(wěn)轉(zhuǎn)即病毒感染，是利用慢病毒將外源插入整合到宿主細(xì)胞的基因組，從而達(dá)到持久性表達(dá)。穩(wěn)轉(zhuǎn)是基因組整合到宿主細(xì)胞基因組，跟隨細(xì)胞一起增值得以穩(wěn)定遺傳；瞬轉(zhuǎn)是質(zhì)粒游離在細(xì)胞內(nèi)，一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，但不能穩(wěn)定遺傳。
Q：所有的細(xì)胞株都可以構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系嗎？
A：不是所有的細(xì)胞株都能構(gòu)建成為穩(wěn)定細(xì)胞系的。構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系需要滿足2個條件：1、細(xì)胞能穩(wěn)定傳代；2、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率滿足要求。
Q：構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株需要的時間以及檢測報告包含那些內(nèi)容？
A：一般穩(wěn)轉(zhuǎn)采用慢病毒方法，多克隆細(xì)胞株需要1個月到1個半月，單克隆細(xì)胞株需要2-3個月時間。檢測報告包含細(xì)胞株構(gòu)建實驗報告、目的基因qPCR檢測報告、含有熒光標(biāo)簽的細(xì)胞提供細(xì)胞熒光照片。如果需要提供Western Blot檢測服務(wù)，需客戶提供一抗并收取額外費用。
細(xì)胞功能研究平臺--案例分析
案例分析（一）
Chebulic Acid（CA）對Methylglyoxal（MG）誘導(dǎo)的INS-1胰腺β細(xì)胞線粒體功能障礙的保護(hù)作用
· 研究思路
原文：Chebulic Acid Prevents Methylglyoxal-Induced Mitochondrial Dysfunction in INS-1 Pancreatic β-Cells. Antioxidants (Basel). 2020 Aug 20;9(9):771. doi: 10.3390/antiox9090771.
案例分析（二）
MCL-1合成增加會通過調(diào)節(jié)ROS/AKT環(huán)促進(jìn)鼻咽癌放射抗性，在世界范圍內(nèi)，鼻咽癌是一種罕見的頭頸部腫瘤， 放射治療是鼻咽癌最重要的治療策略。盡管放射治療是殺死癌細(xì)胞的有力工具，但矛盾的是，它也促進(jìn)了侵襲性表型。 因此，這篇文章在體外模擬鼻咽癌細(xì)胞的治療過程。在暴露于輻射后，鼻咽癌細(xì)胞亞群逐漸對輻射產(chǎn)生抵抗力，并顯示 出癌癥干細(xì)胞的特征。輻射誘導(dǎo)的干細(xì)胞能力在很大程度上取決于抗凋亡髓系細(xì)胞白血病1(MCL-1)蛋白的積累。
原文：Increased MCL-1 synthesis promotes irradiation-induced nasopharyngeal carcinoma radioresistance via regulation of the ROS/AKT loop. Cell Death Dis. 2022 Feb 8;13(2):131. doi: 10.1038/s41419-022-04551-z.
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