細(xì)胞技術(shù)--穩(wěn)定株篩選

穩(wěn)定株篩選

研究某個(gè)基因的功能最常用的手段是在宿主細(xì)胞中過量表達(dá)或者通過RNA干擾的方法knock-down該基因,常規(guī)手段有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定細(xì)胞系。

篩選出該基因的過表達(dá)或者RNA干擾的穩(wěn)定細(xì)胞系會給您的實(shí)驗(yàn)帶來極大的便利。有了穩(wěn)定細(xì)胞系,后期的Co-IP或者Pull-Down實(shí)驗(yàn)會非常便利;穩(wěn)定表達(dá)重組熒光蛋白的細(xì)胞系可以讓您動(dòng)態(tài)的觀察分子在細(xì)胞中的運(yùn)動(dòng)。 構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選。最常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418來代替新霉素進(jìn)行選擇性篩選,篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白,或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株。

篩選穩(wěn)定細(xì)胞系的方法

1)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,單克隆方法篩選穩(wěn)定細(xì)胞系

2)慢病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞系

慢病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效,是目前主流的穩(wěn)定細(xì)胞系篩選方法。慢病毒幾乎可以感染所有種類的細(xì)胞,并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組,進(jìn)行長時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá),因此,慢病毒常用于制備穩(wěn)定表達(dá)/沉默特定基因的單克隆細(xì)胞株。