平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)

平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)

克隆形成試驗(yàn)可反映細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力。一般細(xì)胞在體外增殖六代以上,其后代形成的細(xì)胞群體稱(chēng)為細(xì)胞集落或克隆。每個(gè)克隆由單一細(xì)胞而來(lái),含有50個(gè)以上細(xì)胞,大小在0.3-1mm之間。通過(guò)克隆形成可檢測(cè)各種理化因素對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響。平板克隆形成試驗(yàn)可檢測(cè)貼壁細(xì)胞細(xì)胞的克隆形成能力,軟瓊脂集落形成試驗(yàn)可檢測(cè)非錨著依賴(lài)生長(zhǎng)的細(xì)胞,如骨髓造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。

基本步驟:

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞,并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。

2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋,每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中,并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng),使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

3、經(jīng)常觀(guān)察,當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí),終止培養(yǎng)。棄去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液,加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30分鐘,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片,用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆,或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率 =(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%

服務(wù)流程:

1) 項(xiàng)目方案的確定,包括目的細(xì)胞、細(xì)胞處理方式及處理時(shí)間等。

2) 細(xì)胞培養(yǎng)

3) 克隆形成實(shí)驗(yàn)

4) 克隆形成實(shí)驗(yàn)圖片及實(shí)驗(yàn)報(bào)告

服務(wù)周期：3～5周