染色質(zhì)免疫沉淀

染色質(zhì)免疫沉淀技術的原理是:在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后,利用抗原抗體的特異性識別反應,將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術一般包括細胞固定,染色質(zhì)斷裂,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn),DNA的純化,以及DNA的鑒定。
1.ChIP是什么?

答:染色質(zhì)免疫沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation,簡稱ChIP)是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術。它利用抗原抗體反應的特異性,可以真實地反映體內(nèi)蛋白因子與基因組DNA結合的狀況。

2.ChIP有哪些應用?

答:近年來由于該技術不斷的發(fā)展和完善,其應用范圍已經(jīng)從研究目的蛋白與已知靶序列間的相互作用,發(fā)展到研究目的蛋白與整個基因組的未知序列的相互作用;從研究一個目的蛋白與DNA的相互作用,發(fā)展到研究兩個蛋白與DNA共同結合的相互作用;從研究啟動子區(qū)域的組蛋白的修飾,發(fā)展到研究結合在DNA序列上的蛋白復合物。

3.ChIP技術的原理?

答:生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后,利用抗原抗體的特異性識別反應,將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術一般包括細胞固定,染色質(zhì)斷裂,染色質(zhì)免疫沉淀,交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn),DNA的純化,以及DNA的鑒定。因為ChIP實驗涉及的步驟多,結果的重復性較低,所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照,而且對結果的分析也需要有一定的經(jīng)驗。

4.做ChIP試驗,必須做甲醛固定么?

答:不一定,視樣品及試驗方案而定。做甲醛固定的為X-ChIP,而不需要固定的為N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)-DNA,蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián),形成生物復合體,防止細胞內(nèi)組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應是完全可逆的,便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質(zhì)進行分析。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。

5.為什么必須將DNA切碎至少于1000bp大小(大約3個核小體 ~400-500bp)?

答:為確保ChIP實驗有良好精度。若您的平均片段長度大于1000bp,您將會分離獲得包含您目標序列的DNA,但所要研究的蛋白會離您目標序列有700個核苷酸的距離。

6.為什么使用鮭魚精子DNA來封閉瓊脂糖珠子?為什么我的樣品中鮭魚精子DNA不會發(fā)生PCR反應?

答:鮭魚精子用于降低降低染色質(zhì)DNA與瓊脂糖珠子的非特異性結合。實驗者不太可能對鮭魚組織做ChIP實驗,所以此DNA不會因交叉雜交而被PCR引物擴增。

7.引物最佳設計是什么樣的?

答:引物長度應為24個核苷酸,應含有50%GC堿基對,Tm值為60°C。不要擴增大于600-800個核苷酸的序列。不必考慮基因組內(nèi)不獨一序列。

8.您推薦下如何從瓊脂糖(或瓊脂糖凝膠)中洗脫抗體-蛋白-DNA復合物,用來做re-ChIP試驗?

答:在ChIP分析試劑盒內(nèi)可找到洗脫緩沖液,用它洗脫復合物。對于re-ChIP,有必要添加蛋白酶抑制劑到免疫沉淀洗液和洗脫緩沖液,及第二輪實驗用的稀釋緩沖液。請確定所有溶液處于低溫,蛋白質(zhì)不會因此而在收集第一次免疫沉淀的復合物或第二次免疫沉淀時降解。

9.蛋白A瓊脂糖能被用于小鼠IgM?

答: 蛋白質(zhì)A不能與小鼠IgM結合�？梢钥紤]用一個橋接抗體連接。

10.在做ChIP之前,有辦法純化細胞核么?

答: 在細胞與甲醛交聯(lián)后,細胞核可通過“溶脹緩沖液”培育及剪刀細胞均質(zhì)器(dounce homogenization)制備(至少10倍體積)。

     溶脹緩沖液:

     25M Hepes, pH 7.8

     1.5mM MgCl2

     10mM KCl

     0.1% NP-40

     1mM DTT

     0.5mM PMSF

     蛋白酶抑制劑混合劑

     然后按照protocol在SDS裂解液中裂解

11.ChIP超聲波的最佳條件?

答: 1. 確定裂解物在冰上放置了至少10分鐘。不要震蕩或者搖晃裂解物,避免有氣飽(氣泡產(chǎn)生)。超聲波儀會替你做這些。

     2.脈沖應在~10秒(與體積一致)。

     3. 樣品量小于400 uL間隔應大于1分鐘,在EP管中的更大體積間隔大于3分鐘。

     4. 避免泡沫。請確定超聲探頭靠近液體底部(不能讓探頭碰到管壁)。

     5.若發(fā)現(xiàn)泡沫,立即停止超聲,置于冰上。旋轉(zhuǎn)EP管以去除泡沫,繼續(xù)超聲。

     6. 在按“開始”鍵之前將探頭置于液體中。

12.客戶能只用哺乳動物細胞的細胞核而不是整個細胞么?

答: 是,實際上比起全細胞,細胞核更好。我們用全細胞裂解物,因為它更簡便,通常也能得到好結果。此頁有一些相關信息:

13.ChIP超聲波的最佳條件?

答: 1. 確定裂解物在冰上放置了至少10分鐘。不要震蕩或者搖晃裂解物,避免有氣飽(氣泡產(chǎn)生)。超聲波儀會替你做這些。

     2.脈沖應在~10秒(與體積一致)。

     3. 樣品量小于400 uL間隔應大于1分鐘,在EP管中的更大體積間隔大于3分鐘。

     4. 避免泡沫。請確定超聲探頭靠近液體底部(不能讓探頭碰到管壁)。

     5.若發(fā)現(xiàn)泡沫,立即停止超聲,置于冰上。旋轉(zhuǎn)EP管以去除泡沫,繼續(xù)超聲。

     6. 在按“開始”鍵之前將探頭置于液體中。

14.客戶能只用哺乳動物細胞的細胞核而不是整個細胞么?

答: 是,實際上比起全細胞,細胞核更好。我們用全細胞裂解物,因為它更簡便,通常也能得到好結果。此頁有一些相關信息:

15.什么是input DNA? Output DNA?

從染色質(zhì)上獲得的未做過IP的已經(jīng)被逆轉(zhuǎn)交聯(lián)的DNA. 它是檢查PCR是否有效的對照。Output DNA是來自每次IP實驗的DNA.

其實就是genomic DNA. 在ChIP實驗中, sonication 或酶解后, 樣本取部分不做IP, 直接逆轉(zhuǎn)交聯(lián). 它的最主要的作用就是檢查PCR系統(tǒng)是否work. 通常情況下, 在該條道中,都可以看到條帶的.如果沒有,說明PCR系統(tǒng)不work.

16.為什么ChIP試驗需要用經(jīng)驗證的抗體?

抗原抗體之間的結合是通過抗體特異性的識別抗原表位并結合的,有的抗體識別的抗原表位比較小,不容易暴露,在ChIP實驗中容易被DNA包裹,從而使抗體無法結合,因此用來做ChIP的抗體一般是需要經(jīng)過chip實驗驗證的,商業(yè)化的抗體都應該是驗證過的。

17.什么是reChIP技術?

ChIP reChIP是在第一次ChIP的基礎上不解交聯(lián),而繼續(xù)進行另一個目的蛋白的免疫沉淀,從而得到與兩種目的蛋白都結合的DNA序列。值得注意的是,因為 通過兩次免疫沉淀富集的DNA量比較少,所以在分析時通常要把多次免疫沉淀的DNA濃縮后再進行操作