蛋白雙向電泳

蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心｡ 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個(gè)E.coli蛋白,并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的,而是隨環(huán)境而變化｡ 雙向電泳原理簡(jiǎn)明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿pH梯度分離,至各自的等電點(diǎn);隨后,再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離｡ 目前,隨著技術(shù)的飛速發(fā)展,已能分離出10000個(gè)斑點(diǎn)(spot)｡ 當(dāng)雙向電泳斑點(diǎn)的全面分析成為現(xiàn)實(shí)的時(shí)候,蛋白質(zhì)組的分析變得可行｡

樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關(guān)2-DE的成效,目標(biāo)是盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚,以提高分辨率｡ 用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白,兩者聯(lián)合有協(xié)同作用｡ 對(duì)IEF(isoelectric focusing)樣品的預(yù)處理涉及溶解､變性和還原來(lái)完全破壞蛋白間的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物質(zhì)｡

 理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的完全處理｡ 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉(zhuǎn)換｡三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP)取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵,增強(qiáng)了蛋白的溶解度,并導(dǎo)致轉(zhuǎn)至第二向的增加]｡ 兩者通過(guò)不同的方法來(lái)增加蛋白的溶解度,作為互補(bǔ)試劑會(huì)更有效｡

 在保持樣品的完整性的前提下,可利用超離和核酸內(nèi)切酶去除核酸(DNA)｡ 除此之外,機(jī)械力被用來(lái)對(duì)蛋白分子解聚,如超聲破碎]等｡ 另外,添加PMSF等蛋白酶抑制劑,可保持蛋白完整性｡ 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的,可在其水化的過(guò)程中加樣,覆蓋整個(gè)IPG膠,避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失]｡ 此外,低豐度蛋白(low abundance protein)在細(xì)胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能,代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”,故分離低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn)｡

亞細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)､提高加樣量(已達(dá)到1~15 mg級(jí)的標(biāo)準(zhǔn))､應(yīng)用敏感性檢測(cè),可以提高其敏感性｡ 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來(lái)分析和檢測(cè)｡ 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點(diǎn)｡ 由于堿性pH范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流(EOF)的產(chǎn)生,對(duì)PI(等電點(diǎn))超過(guò)10的堿性蛋白,通過(guò)產(chǎn)生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之｡ 亦可用雙甲基丙烯酰胺來(lái)增加基質(zhì)的穩(wěn)定性｡

 服務(wù)內(nèi)容:

1､雙向電泳樣本制備與定量;

2､雙向電泳與圖片分析;

3､雙向電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告提交｡

實(shí)驗(yàn)報(bào)告:

1､雙向電泳電子圖片及定量分析結(jié)果,包括差異點(diǎn)號(hào)碼､差異倍數(shù);

2､雙向電泳完整的實(shí)驗(yàn)步驟､使用儀器､軟件檢索參數(shù)等