抗體表達CHO細胞株的構建策略與流程

抗體廣泛存在于生物醫(yī)學研究、 診斷和治療的發(fā)展中， 且需求量大。然而， 滿足全球市場日益增長的抗體需求量是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了維持抗體的供求平衡， 科學家們發(fā)明了更好的方法來優(yōu)化抗體的表達， 以達到增加抗體的單體積表達量并減少生產成本。由于新的克隆方法、基因改造技術以及一系列的細胞和載體工程技術， 加上發(fā)酵技術上的改進， 這些都使抗體表達大大得益。

哺乳動物細胞是臨床抗體藥物產品使用的主要表達系統(tǒng)， 主要包括Sp2/0骨髓瘤細胞、 NS0小鼠骨髓瘤細胞、 HEK293人胚胎腎細胞和CHO中國倉鼠細胞， 其中以CHO系應用最為廣泛。

海星生物致力于工程細胞株構建和改造，為科研加速，為工業(yè)賦能！

 

一、基于CHO細胞的抗體表達系統(tǒng)簡介 

 

CHO細胞譜系 

細胞株開發(fā)常用的CHO細胞：DG44, DUXB11, CHO-S, CHO-K1 WT, CHO-K1 GS-/-

篩選標記	篩選試劑
代謝型篩選標記 (擴增型基因篩選標記)	二氫葉酸還原酶（DHFR）	甲氨蝶呤 (MTX)
	谷氨酰胺合成酶（GS）	氨基亞砜蛋氨酸 (MSX)
抗生素篩選標記 (非擴增型基因篩選標記)	嘌呤霉素搞性（Puromycin acetyltransferase）	嘌呤霉素 (Puromycin)
	殺稻瘟脫氫酶（Blasticidin deaminase）	殺稻瘟霉素 (Blasticidin)
	組氨醇脫氫酶（Histidinol dehydrogenase）	組氨醇 (Histidinol)
	潮霉素磷酸轉移酶(Hygromycin phosphotransferase)	潮霉素 (Hygromycin)
	氯林可霉素而藥基因（Zeocin resistance gene）	氯林可霉素 (Zeocin)
	博來霉素耐藥基因（Bleomycin resistance gene）	博來霉素 (Bleomycin)
	氨基糖苷磷酸轉移酶（Aminoglycoside phosphotransferase）	新霉素 (Neomycin or G418)

 

CHO細胞的優(yōu)點

1. CHO細胞遺傳背景清晰， 不易傳播人類病毒， 具有很高的安全性， 以CHO作為宿主細胞表達生物蛋白質， 容易被藥物審核機構， 如FDA審批通過
2. CHO細胞可以通過懸浮馴化適應無血清懸浮培養(yǎng)， 并能夠實現(xiàn)在無血清培養(yǎng)基中快速及高密度生長，這為藥物的質量控制和大規(guī)模生產帶來極大的便利和實惠；
3. CHO細胞表達的重組蛋白質能夠獲得類似于人源蛋白質的翻譯后修飾， 如翻譯后的糖基化修飾、 唾液酸化修飾等， 生產的蛋白質較其它表達系統(tǒng)更加與人體天然的生物蛋白質相似第四， 較少分泌內源性蛋白， 降低純化難度；
4. CHO細胞已經開發(fā)出了多種商業(yè)化高效高表達系統(tǒng)， 如二氫葉酸還原酶篩選體系、 谷氨酰胺合成酶篩選體系和遺傳霉素篩選體系等。 

CHO細胞的異質性特征

CHO細胞在長期傳代過程中存在的穩(wěn)定性表達問題， 主要體現(xiàn)在：
1. CHO 細胞遺傳不穩(wěn)定性引起的表達不穩(wěn)定
CHO 細胞系基因組本身具有不穩(wěn)定性。通常， 中國倉鼠體細胞的染色體為 11 對22 條， 而中國倉鼠卵巢細胞的染色體則發(fā)生了大面積不穩(wěn)定重排重組現(xiàn)象， 不同細胞系染色體的數(shù)目也不恒定�；�因組的不穩(wěn)定性， 主要表現(xiàn)在其染色體層面上的拷貝數(shù)變異。

2. 外源基因隨機整合引起的表達不穩(wěn)定
傳統(tǒng)方法主要是通過表達質粒轉染后， 利用壓力篩選從而獲得目的蛋白質表達細胞株。因此， 外源基因都是通過隨機整合方式， 整合到CHO 基因組內。由于整合位點的不確定性， 可能在細胞培養(yǎng)后期引起表達不穩(wěn)定。

中國倉鼠卵巢細胞擁有22 條染色體， 其中10 對常染色體及2 條性染色體。而CHO-K1 細胞系則顯示出與其有極大的不同，其僅有8 條染色體顯示出同普通中國倉鼠染色體相同， 而13個染色體則以“Z” 標志， 因其中包含著染色體重排、 缺失、移位等現(xiàn)象。

 

二、抗體表達CHO細胞株的構建策略與流程 

 

1. 細胞內的蛋白表達過程

轉錄 → mRNA加工 → 翻譯 → 翻譯后折疊與修飾 → 細胞內轉運 → 分泌

2. 抗體表達CHO細胞株的構建策略

Representation of different steps involved in building an efficient system for protein expression

 

3. 重組蛋白表達工程細胞株的構建流程圖

載體構建 →  轉染 → 細胞池(pool) 篩選 → 單克隆化篩選 → 批次補料培養(yǎng)篩選 → 蛋白質量篩選 → 細胞株最終選定與建庫 → 細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)與生產

（1）重組抗體表達載體構建：載體元件改造， 密碼子優(yōu)化， 信號肽優(yōu)化等

（2）影響細胞轉染環(huán)節(jié)的因素：轉染效率和細胞活性

（3）單克隆篩選：有限稀釋法、ClonePix、FACS

細胞的克隆形成是一個緩慢而且效率很低的技術過程，但是很多細胞實驗都需要經過一個單克隆生長階段，為了增加細胞株的克隆形成的效率，我們研發(fā)了該款細胞培養(yǎng)基。ClonePlusTM培養(yǎng)基含有多種細胞培養(yǎng)添加成分，包括：

海星生物使用ClonePlusTM培養(yǎng)基測試多種工程細胞株、腫瘤細胞株、原代細胞株、干細胞株等都能提高20～150%的克隆形成效率（數(shù)據(jù)來自同一株細胞對比）。

 

三、優(yōu)化抗體表達水平的思路與方法

1. 載體設計優(yōu)化
表達載體的設計需要適應表達系統(tǒng)， 以增加抗體的表達， 增加細胞穩(wěn)定性， 提高轉錄， 分泌， 選擇， 整合的效率。
（1）多種表達載體形式
單順反子載體， 多啟動子表達載體， 以及IRES或Furin-2A元件介導的多順反子載體等。

（2）表達載體元件選擇
啟動子與增強子：CMV啟動子、 SV40啟動子、 EF-1α啟動子、 CAG啟動子等
PolyA：BGH PolyA、 SV40 PolyA等
篩選標記：代謝型篩選標記MTX/MSX， 抗生素篩選標記等

（3）位置效應與整合位點優(yōu)化
染色質開放元件、 支架區(qū)/基質附著區(qū)（S/MAR） 、 FRT/FLP系統(tǒng)、 Cre-loxp系統(tǒng) 

VIRUS-Free™基因導入系統(tǒng)優(yōu)勢：

· 穩(wěn)定整合效率高
· 插入片段大小不受限制
· 表型穩(wěn)定

 

2. 基因定點整合

使用重組酶系統(tǒng)進行基因定點整合：
首先需要構建平臺細胞， 利用模式蛋白（如 GFP 等） 篩選得到宿主細胞基因組中的高表達位點，之后利用 重組酶的特異性， 實現(xiàn)目的基因在該位點的定點整合。
如Flp/FRT 重組酶、 Cre/loxp 重組酶、PhiC31 重組酶、 Bxb1 重組酶等重組酶系統(tǒng)

3. 工程化細胞株馴化和改造

宿主細胞關鍵調節(jié)基因上調或者下調表達

靶向CHO細胞關鍵調節(jié)基因， 通過基因工程手段改造和馴化產生CHO細胞亞系，使表現(xiàn)出更好的凋亡抗性、 代謝、 糖基化、 蛋白表達、 細胞周期調節(jié)、 增殖、 分泌或細胞骨架動力學。

4. 從實際細胞株構建問題中排查優(yōu)化
對于一個表達量低于預期的抗體， 可選取一個參考表達量正常的抗體進行對照進行研究：
（1） 探究整合位點的異質性影響
（2） 探究表達產物對細胞是否有影響
（3） 探究基因轉錄水平是否正常
（4） 探究目的蛋白的分泌情況
（5） 探究目的蛋白的折疊裝配情況