CRISPR-gRNA文庫篩選基因靶點服務

|   CRISPR-gRNA文庫篩選基因靶點服務

CRISPR-gRNA文庫是高通量篩選靶基因的重要工具，可用于大規(guī)�；蛉�基因組功能篩選，涉及信號通路、疾病、細胞藥物應答、發(fā)育、基因調(diào)控等方面。海星生物在gRNA文庫篩選方面擁有豐富的經(jīng)驗，能夠幫助客戶快速構(gòu)建CRISPR KO（基因敲除）、CRISPRa（基因激活）文庫、CRISPRi（基因抑制/沉默），也可以為客戶提供全套的細胞功能篩選服務，涵括文庫構(gòu)建、病毒文庫、細胞轉(zhuǎn)染和篩選、NGS測序與數(shù)據(jù)分析服務。

|   CRISPR-gRNA文庫服務流程和優(yōu)勢

CRlSPR/Cas9是細菌和古生物菌用來抵抗外來入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。利用CRlSPR/Cas9技術(shù)建立的全基因組突變（基因敲除）庫或者與某類功能相關(guān)的基因突變體（基因敲除）庫，通過功能性篩選和富集以及隨后的PCR擴增和深度測序（NGS）分析，篩選出與感興趣的表型相關(guān)的基因的過程，被稱為CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選。gRNA文庫篩選是藥物篩選或靶向篩選特定通路的理想工具，可以撥開基因研究的迷霧，為研究者找出相關(guān)的基因。文庫篩選是將功能基因篩選、疾病機制研究及藥物研發(fā)等方面結(jié)合在一起，必將發(fā)揮重要價值。

CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選流程：

1. CRlSPR/Cas9 gRNA文庫選擇；

2. CRlSPR/Cas9 gRNA文庫擴增；

3. CRlSPR/Cas9 gRNA文庫慢病毒包裝；

4. CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選；

5. PCR擴增和NGS測序、數(shù)據(jù)分析；

1、CRlSPR/Cas9 gRNA文庫選擇

首先客戶選擇所需gRNA文庫。如果客戶根據(jù)具體需要提出文庫定制，我們將根據(jù)客戶提供的基因群信息進行單個基因的gRNA設計，保證每個基因設計4~6個（2~3對）不同的gRNA，最大程度確�；�因功能的突變。我們采用的載體是單/雙載體，單載體是一個載體上同時攜帶單個gRNA和cas9基因，雙載體是一個載體上只有單個gRNA，cas9蛋白則由單獨攜帶cas9的載體提供。這兩種模式載體均攜帶有額外的抗性篩選標記。

服務優(yōu)勢：設計文庫構(gòu)建方案

我們擁有強大的計算機資源和優(yōu)化的流程。不需要您提供備選的gRNA序列，我們可以為您全新設計。您可根據(jù)研究需要精準度和深度，選擇我們經(jīng)過驗證的載體骨架來構(gòu)建文庫，如慢病毒等。對于雙載體系統(tǒng)CRISPR文庫（CRISPR載體和gRNA載體），我們還可以根據(jù)您的篩選策略，設計和構(gòu)建相應的Cas9或Cas9變體表達載體，滿足多種研究的需求。

2、CRlSPR/Cas9 gRNA文庫擴增

經(jīng)合成的片段一般較少，不足以進行文庫的慢病毒包裝和使用。因此，需要對上述載體進行擴增，增加總量。上述gRNA載體構(gòu)建完成后，我們將這些載體按相同的比例混合成一個pool（即載體混合物），隨后將載體混合庫使用專用電轉(zhuǎn)感受態(tài)（高效率感受態(tài)），電轉(zhuǎn)擴增培養(yǎng)并收集菌落，并進行擴大培養(yǎng)，最后大規(guī)模抽提質(zhì)粒，即得到了擴增后的載體混合庫，也就是敲除的載體文庫。

服務優(yōu)勢: 精準PCR擴增構(gòu)建CRISPR文庫

我們使用芯片合成的方法獲得高質(zhì)量的gRNA引物庫。以引物庫為模板，使用最低有效循環(huán)數(shù)進行PCR擴增，并以平均100x的覆蓋率克隆到目的載體骨架上。將CRISPR文庫質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行擴增培養(yǎng)后，取對數(shù)生長期的菌液制備成甘油菌進行保存。評估文庫的質(zhì)量，對gRNA質(zhì)粒DNA庫進行NGS測序分析，測序深度將達到500x覆蓋率，分析出來的數(shù)據(jù)將形成報告。

服務優(yōu)勢：預制質(zhì)粒DNA文庫的擴增

我們可以接受其他來源（例如Addgene）的預制質(zhì)粒DNA文庫。首先我們會將質(zhì)粒DNA文庫轉(zhuǎn)化超級感受態(tài)細胞，達到100x覆蓋率，取對數(shù)生長期的大腸桿菌培養(yǎng)物制備成甘油菌。同時我們還會對轉(zhuǎn)化后的菌落進行計數(shù)以評估gRNA實際平均數(shù)量。并將質(zhì)粒DNA文庫交付大提，并進行病毒包裝。我們可以在轉(zhuǎn)化前和/或轉(zhuǎn)化后對您的質(zhì)粒DNA文庫進行NGS測序驗證。對于您提供的質(zhì)粒DNA文庫，我們可以通過克隆計數(shù)保證達到100x覆蓋率，但不能保證文庫的多樣性和均一性，因為我們無法控制您的預制質(zhì)粒DNA庫質(zhì)量。

3、CRlSPR/Cas9 gRNA文庫質(zhì)粒質(zhì)檢、抽提、慢病毒包裝

擴增后的gRNA文庫進行慢病毒的包裝。由于文庫是由多個不同的gRNA載體混合而成，因此我們獲得的慢病毒是病毒文庫，但是里面的每個病毒攜帶單個gRNA載體。

服務優(yōu)勢：病毒文庫的包裝

對于CRISPR文庫篩選，需要通過病毒（如慢病毒或腺相關(guān)病毒）將文庫轉(zhuǎn)到細胞中。而具體的轉(zhuǎn)染的效果需要進行MOI測試，我們可以依據(jù)客戶的需求進行目的細胞的病毒感染的MOI優(yōu)化和摸索。

4、CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選

對篩選的目的細胞進行病毒感染預實驗，得到細胞在較低的MOI時感染百分數(shù)，以確認感染時gRNA文庫的病毒用量。慢病毒庫以較低的MOI值感染細胞（確保每個細胞只進入一個慢病毒），隨后根據(jù)實驗目的而對細胞采用相應的處理，最后經(jīng)過不同的篩選方式富集細胞。以耐藥性基因篩選實驗為例，根據(jù)前期藥物IC50實驗，得到藥物篩選實驗的處理濃度。采用高濃度藥物處理感染后的細胞，經(jīng)過篩選后存活的細胞則具有一定的耐藥性，將此群細胞擴增并收集下來，耐藥性的來源是CRlSPR/Cas9 gRNA對相應基因的修飾。

5、PCR擴增和NGS測序

對上個環(huán)節(jié)篩選中富集下來的細胞進行慢病毒載體的PCR擴增，該擴增片段包含載體所攜帶的gRNA序列，通過后續(xù)的NGS測序，我們可以得到富集細胞中g(shù)RNA的富集度，從而尋找到相應的基因，這些基因很有可能參與藥物作用過程，因此可作為深入研究的待選基因。

服務優(yōu)勢：功能篩選樣品NGS測序分析

功能篩選后，可以直接將基因組DNA樣品寄送給我們，我們將為您制備NGS樣品、高通量測序和數(shù)據(jù)分析，并在短短幾周內(nèi)告知您樣品的gRNA的分布情況。測序完成后，我們會通過電子郵件通知您，并附帶詳細的數(shù)據(jù)報告。

|   CRISPR文庫遺傳篩選的常規(guī)流程

|   服務類型介紹：