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CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在疾病基礎(chǔ)研究、靶點驗證、藥物分子的高通量篩選、以及遺傳性疾病的治療等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。
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gRNA的設(shè)計
gRNA設(shè)計的在線工具很多，常用的如張鋒實驗的CRISPOR（http://crispor.tefor.net/），只需輸入目標序列，種屬基因組與相應(yīng)的PAM，則可以得出多個gRNA，以及每個gRNA對應(yīng)的特異性、切割效率和潛在脫靶位點，一般選擇特異性、切割效率得分高的gRNA。
但是很多實驗需要根據(jù)經(jīng)驗設(shè)計sgRNA。如果需要手動設(shè)計gRNA，則需要考慮其特異性與切割效率。在靶點設(shè)計時要綜合考慮所有候選靶點的序列、位置、正負鏈、GC含量、潛在的脫靶位點等信息。
sgRNA設(shè)計的一般流程
1. 分析靶基因信息
2. 選擇靶標區(qū)域設(shè)計sgRNA
3. 脫靶分析
艾迪優(yōu)勢：
1. 10年基因編輯研發(fā)經(jīng)驗，3年CRO服務(wù)
2. 自主知識產(chǎn)權(quán)sgRNA設(shè)計邏輯，數(shù)千例成功基因編輯sgRNA案例
3. 基因編輯治療的實踐經(jīng)驗
附：sgRNA設(shè)計，你需要注意那些問題？
靶基因信息的分析。在NCBI、Ensembl等查詢過程中要注意物種的選擇和確定靶基因在數(shù)據(jù)庫中的登錄號，避免查找錯誤，再進一步關(guān)注其所在基因座上下游基因情況、轉(zhuǎn)錄本數(shù)量、外顯子數(shù)量及長度、翻譯起始位點與終止位點等信息。
靶區(qū)域的選擇原則
對于基因敲除可采用移碼突變和片段敲除，一般采用移碼突變，2種不同策略需遵循以下原則：不影響其他基因，尤其是編碼蛋白的基因；所敲除的外顯子編碼序列之和為非3的倍數(shù)；盡可能影響所有的轉(zhuǎn)錄本；不會殘留蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。
