細(xì)胞基因定點(diǎn)敲入服務(wù)

Cas9-Cell line Knock-In service（Cas9-CKI）基因定點(diǎn)敲入細(xì)胞系是Cas9X技術(shù)團(tuán)隊(duì)針對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的各種細(xì)胞系，研究并確立針對(duì)不同的細(xì)胞的外源基因或者片段高效敲入（Knock-in, KI）的技術(shù)操作規(guī)程，主要目的就是：解決KI效率低下和KI片段長(zhǎng)度限制的問(wèn)題。

目前使用Cas9的進(jìn)行基因KI研究方法，主要應(yīng)用在目的基因后面加上標(biāo)簽，對(duì)目的蛋白進(jìn)行定位；再有就是通過(guò)對(duì)小鼠細(xì)胞的目的基因進(jìn)行修飾替換成為人的基因，用于動(dòng)物的CDX模型等。KI實(shí)現(xiàn)的方案包括：使用合成的Oligo或者ssDNA（single-stranded DNA，ssDNA）作為“Donor”來(lái)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段的敲入；也可以通過(guò)AAV病毒的方式（其病毒以ssDNA的方式存在于細(xì)胞核中）導(dǎo)入ssDNA作為“Donor”載體，也可以通過(guò)dsDNA片段或者環(huán)狀質(zhì)粒作為“Donor”來(lái)實(shí)現(xiàn)KI的目的。

但是不同的細(xì)胞模型KI的效率依然不能令人滿意，且不同的細(xì)胞系之間的效率差異很大，很多細(xì)胞無(wú)法實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的KI。 Cas9X針對(duì)不同的片段的長(zhǎng)度和不同的細(xì)胞特性使用不同的KI策略：小的片段使用Oligo進(jìn)行KI，再長(zhǎng)一點(diǎn)的使用ssDNA進(jìn)行KI，如果長(zhǎng)度超過(guò)1Kb的將使用重組的辦法進(jìn)行KI。針對(duì)細(xì)胞系的KI效率非常低的，需要先構(gòu)建Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株再進(jìn)行g(shù)RNA和Donor的轉(zhuǎn)染來(lái)提高KI效率。Cas9X努力優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件滿足不同細(xì)胞系和不同片段長(zhǎng)度的KI服務(wù)需求。

Cas9X將為你的細(xì)胞探索優(yōu)化的KI實(shí)驗(yàn)方案。

|   技術(shù)原理圖

|   技術(shù)流程圖

|   基因敲入項(xiàng)目名稱

構(gòu)建eGFP基因敲入的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞
 
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

種屬：Human； 基因名稱：PRNP
gRNA位點(diǎn)：ATCTTCCTGATAGTGGGATGAGG
Donor載體：5'arm-eGFP-3'arm
 

細(xì)胞信息

種屬：Human； 細(xì)胞名稱：人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251
培養(yǎng)基：DMEM，10%FBS
 
細(xì)胞檢測(cè)

無(wú)菌檢測(cè)：合格； 支原體檢測(cè)：合格
細(xì)胞克隆形成率檢測(cè)：細(xì)胞增殖能力較好，克隆形成率較好。
細(xì)胞基因型檢測(cè)：針對(duì)gRNA打靶位置及其附近基因組序列進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與理論序列一致。
 
細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)                                                           

電轉(zhuǎn)參數(shù)：1005V，35ms，2次； 電轉(zhuǎn)體系：10 uL
 
PCR篩選

篩選克隆數(shù)量：160； 陽(yáng)性數(shù)量：10
電泳圖示例：

 
克隆狀態(tài)

1.  Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).

2. Sojung Kim, D.K. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 10.1101/gr.171322.113 (2014).
3. Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biol. 2017;18(1):92.
4. Kan Y, Ruis B, Takasugi T, Hendrickson EA. 2017. Mechanisms of precise genome editing using oligonucleotide donors. Genome Research 27, 1099–1111.