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外泌體：一種由活細胞主動釋放的細胞膜內(nèi)陷形成且特異性包裹了多種RNA和蛋白質(zhì)的囊泡，直徑約為30-150nm。外泌體特異性攜帶的多種分子是其參與細胞間通訊的物質(zhì)基礎...
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外泌體：一種由活細胞主動釋放的細胞膜內(nèi)陷形成且特異性包裹了多種RNA和蛋白質(zhì)的囊泡，直徑約為30-150nm。外泌體特異性攜帶的多種分子是其參與細胞間通訊的物質(zhì)基礎，并且不同細胞類型來源的外泌體還分別參與了機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、腫瘤侵襲等多種功能活動，這引起了研究者對其功能探索的極大興趣。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有細胞類型均可分泌外泌體，不同來源外泌體反映了疾病的信息，非常適合作為Biomarker，且外泌體天然存在于多種體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁，這也使得研究者加強了在外泌體中開發(fā)診斷和預后相關Biomarker的研究。
上海生物芯片有限公司為您在外泌體Biomarker的研究中提供了一站式解決方案，包括從樣本中進行外泌體分離、鑒定顆粒粒徑及濃度、針對外泌體優(yōu)化的基因芯片、二代測序和4D質(zhì)譜檢測進行高通量篩選、機器學習算法幫助Biomarker發(fā)現(xiàn)以及數(shù)字PCR和Simoa的精確驗證。
方案設計
納米顆粒跟蹤分析（NTA）介紹
目前主要的外泌體分離方法是依據(jù)外泌體直徑、結(jié)構(gòu)等特點進行富集，或?qū)μ囟さ鞍走M行捕獲，產(chǎn)物中不可避免包含一些其他類型的囊泡，需要對外泌體進行鑒定，以保證其濃度和純度。2014年國際細胞外囊泡學會（ISEV）提出，外泌體鑒定分為三個層面：電鏡鑒定形態(tài)學特征、NTA鑒定粒徑和濃度及蛋白標志物的檢測。
Zetaview（ParticleﾠMetrix）可快速、穩(wěn)定地進行外泌體粒徑、濃度和純度鑒定。其方法原理為納米顆粒跟蹤分析（NanoparticleﾠTrackingﾠAnalysis，NTA）、單一顆粒跟蹤技術并結(jié)合經(jīng)典微電泳技術（zeta電位）和布朗運動，利用Stockes-Einsteinﾠ方程式計算出納米顆粒的流體力學直徑和濃度。NTA技術通過搭配相應濾光片測量熒光抗體（如CD9,CD63, CD81等）標記的外泌體來測定外泌體純度，其優(yōu)點為簡單、快速，且不破壞外泌體原始狀態(tài)。
上海生物芯片有限公司為您在外泌體Biomarker的研究中提供了一站式解決方案，包括從樣本中進行外泌體分離、鑒定顆粒粒徑及濃度、針對外泌體優(yōu)化的基因芯片、二代測序和4D質(zhì)譜檢測進行高通量篩選、機器學習算法幫助Biomarker發(fā)現(xiàn)以及數(shù)字PCR和Simoa的精確驗證。
方案設計
納米顆粒跟蹤分析（NTA）介紹
目前主要的外泌體分離方法是依據(jù)外泌體直徑、結(jié)構(gòu)等特點進行富集，或?qū)μ囟さ鞍走M行捕獲，產(chǎn)物中不可避免包含一些其他類型的囊泡，需要對外泌體進行鑒定，以保證其濃度和純度。2014年國際細胞外囊泡學會（ISEV）提出，外泌體鑒定分為三個層面：電鏡鑒定形態(tài)學特征、NTA鑒定粒徑和濃度及蛋白標志物的檢測。
Zetaview（ParticleﾠMetrix）可快速、穩(wěn)定地進行外泌體粒徑、濃度和純度鑒定。其方法原理為納米顆粒跟蹤分析（NanoparticleﾠTrackingﾠAnalysis，NTA）、單一顆粒跟蹤技術并結(jié)合經(jīng)典微電泳技術（zeta電位）和布朗運動，利用Stockes-Einsteinﾠ方程式計算出納米顆粒的流體力學直徑和濃度。NTA技術通過搭配相應濾光片測量熒光抗體（如CD9,CD63, CD81等）標記的外泌體來測定外泌體純度，其優(yōu)點為簡單、快速，且不破壞外泌體原始狀態(tài)。
實際樣品檢測結(jié)果圖
SBC自主研發(fā)的外泌體蛋白鑒定Pane（l Digital Western Blot）
外泌體組學高通量篩選
不同類型的細胞在不同生理、病理狀態(tài)下，所分泌的外泌體中包含的RNA與蛋白質(zhì)分子不同，這些分子以外泌體為載體進入靶細胞后，會通過不同的機制對靶細胞產(chǎn)生影響。
SBC 根據(jù)多年高通量實驗服務經(jīng)驗，經(jīng)過多次實驗優(yōu)化開發(fā)了適合外泌體RNA（mRNA、lncRNA、circRNA 及miRNA等）和蛋白質(zhì)分析的基因芯片、二代測序以及4D 質(zhì)譜檢測服務，全面提升了外泌體研究的廣度與深度。SBC 提供的高通量篩選工具如下：
機器學習篩選Biomarker
基于外泌體基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集（mRNA, lncRNA, circRNA 和蛋白質(zhì)可單獨或者集合使用），采用機器學習算法的訓練和測試，并評估性能，以此來篩選診斷或預后的Biomarker。
外泌體驗證利器—微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）
基于泊松分布原理建立的一種核酸分子絕對定量技術。通過微滴發(fā)生器形成上萬個微滴，其中每個微滴或不含或含有一個至數(shù)個核酸靶標分子。每個單分子進行PCR擴增，探針用于檢測特定序列的靶標。隨后逐個對每個微滴檢測有無熒光信號，最終根據(jù)陽性微滴的比例，按照泊松分布的原理，通過軟件計算出待檢靶分子的拷貝數(shù)。
>> 儀器
微滴式數(shù)字PCR - BIORAD QX200，可對DNA或RNA分子進行絕對定量分析，適用于EvaGreen或探針的數(shù)字PCR。
>> 主要特點
1、便捷的測定設計，不需要標準曲線
2、可通過增加PCR反應的數(shù)量提高精確度
3、可高度耐受PCR反應抑制劑
4、可精確鑒定目標拷貝數(shù)，分析微小差異
5、簡便而易用的工作流程，一次可以檢測 96 個樣品
6、靈活的數(shù)字 PCR 化學方法，已針對 TaqMan 水解探針和 EvaGreen 測定進行優(yōu)化
外泌體蛋白質(zhì)驗證利器--單分子免疫陣列分析（Simoa）
Simoa技術采用經(jīng)典的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）實現(xiàn)極低含量的蛋白定量檢測。其關鍵技術在于將免疫復合物捕獲并密封在一個含有超過20萬個飛升級別小孔的芯片中反應，以實現(xiàn)單個分子的檢測，大幅提升檢測靈敏度，因此有被稱為數(shù)字式ELISA，比傳統(tǒng)ELISA方法靈敏度高出1000倍。Simoa技術可對傳統(tǒng)方法無法檢測到的低濃度生物標志物進行準確分析，為生命科學研究、體外診斷、伴隨診斷和血液篩查等領域開創(chuàng)了新的研究前景。
>> 儀器
美國Quanterix公司研發(fā)的Simoa HD-X數(shù)字式單分子免疫陣列分析儀，可以直接對血清、血漿等體液和外泌體中的蛋白進行超高靈敏度檢測。
>> 主要特點
1、靈敏度高：比現(xiàn)有的常規(guī)免疫檢測方法靈敏度平均高1000倍以上，可檢測非常低濃度的蛋白標志物，同時為檢測和驗證新的生物標志物提供了有力工具。所需樣本含量少，節(jié)約珍貴樣本，減少基質(zhì)效應。
2、全自動化：SimoaﾠHD-X分析儀自動化完成稀釋、混合、洗滌、孵育以及結(jié)果的讀出/分析，實現(xiàn)從樣本到結(jié)果一站式檢測，不依賴工作人員，保證結(jié)果的重復性和精準性。
3、多重檢測：統(tǒng)一芯片內(nèi)可以同時完成多達10種不同目標分子的檢測，可在一個樣本中同時檢測多個指標，減少了樣本與實際使用量，節(jié)約了成本。
4、高精準度：數(shù)字化和自動化技術使實驗結(jié)果的變異系數(shù)（CVs）低于10%，結(jié)果科學可靠。
5、線性范圍廣：針對低濃度和高濃度樣本分別采用數(shù)字檢測和模擬檢測兩種數(shù)據(jù)分析方式，檢測動態(tài)范圍＞ 4 個數(shù)量級。
6、自主研發(fā)：提供多種商品化試劑盒，用戶還可以利用SimoaﾠHomebrew試劑盒進行實驗方案開發(fā)和優(yōu)化，適合于科研創(chuàng)新和開放性研究。
應用案例（一）
外泌體中長鏈RNA作為胰腺管腺癌診斷標志物研究
影響因子：31.79 發(fā)表時間：2020.03 發(fā)表期刊：Gut
胰腺導管癌（PDAC）在能進行手術切除階段被診斷出來是比較困難的，常用標志物CA19-9的靈敏度只有75.4%，特異性77.6%。這篇發(fā)表在Gut上的研究工作，在循環(huán)系統(tǒng)的血漿外泌體中鑒定出由8個基因組成的命名為d-signature的診斷標志物組合，能夠以更高靈敏度及特異性診斷PDAC，并很容易診斷出stageﾠI/II的PDAC。d-signature還可以區(qū)分CA19-9陰性PDAC病例和健康對照組，從而補充CA19-9在PDAC診斷中的應用，為病人爭取手術治療的窗口期。在PDAC與慢性胰腺炎的鑒別也具有較高的準確性，減少不必要的手術。
文章對117例健康對照，284例PDAC和100例慢性胰腺炎病人的血漿分離外泌體，并對外泌體進行鑒定（圖1）。進一步對外泌體RNA進行全轉(zhuǎn)錄組測序分析（圖2），并與TCGAﾠ178個PDAC組織數(shù)據(jù)和GTEx171正常胰腺組織數(shù)據(jù)整合，篩選外泌體和組織中共同上調(diào)基因398個(FDR<0.05,fold change >1.4)。
對候選的標志物基因，利用機器學習方法LASSO和隨機森林訓練出8個基因組成的診斷標志物組合d-signature（圖3，4）。
該研究表明了外泌體RNA 在更高精準地發(fā)現(xiàn)并建立PDAC 診斷標志物中的價值。驗證的標志物組合d-signature對可切除的PDAC 診斷有潛在的臨床應用價值，可以減少患者錯過手術治療的窗口期，使其從最佳治療中獲益。
應用案例（二）
外泌體蛋白質(zhì)組研究哮喘患者單核細胞來源的樹突狀細胞功能
影響因子：14.290 發(fā)表時間：2021.4.25 發(fā)表期刊：J Allergy Clin Immunol
外泌體已成為細胞間通訊中的重要角色。氣道上皮細胞（AECs）是抵御外源抗原的第一道防線，然而，呼吸道上皮細胞（AECs）產(chǎn)生的外泌體是否參與哮喘的發(fā)生尚不清楚。研究者用屋塵螨（HDM）刺激的AECs分泌的外泌體或單核細胞來源的樹突狀細胞（moDCs）（被HDM和/或CNTN1蛋白激活）處理小鼠，發(fā)現(xiàn)前者可以在細胞培養(yǎng)基和小鼠中促進moDCs的富集、增殖、遷移和激活。在哮喘疾病中，外泌體中的CNTN1是一個關鍵要素。RNAi介導的沉默和藥物抑制劑實驗證實Notch2受體是轉(zhuǎn)導CNTN1信號從而激活Th2/Th17免疫反應的必要因素。對哮喘患者的隊列研究也支持上述在細胞和小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的CNTN1-Notch2 軸效應。
PBS-pAECs-EXO和HDM-pAECs-EXO上清中的外泌體（或BEAS-2B細胞）進行了LabelﾠFree蛋白質(zhì)組學分析, 發(fā)現(xiàn)CNTN1 是重要的差異蛋白，在HDM-pAECs-EXO 上清外泌體中高表達。
CNTN1以Notch2信號依賴的方式誘導DCs激活，從而促進過敏性呼吸道炎癥。
CNTN1以Notch2信號依賴的方式誘導DCs 激活，從而促進過敏性呼吸道炎癥。
本研究表明，AECs分泌的外泌體參與調(diào)節(jié)DCs引發(fā)的過敏反應，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。同時研究還進一步證實了，AECs-EXO攜帶的CNTN1蛋白通過Notch2信號通路誘導DCs活化，從而促進哮喘進程。靶向CNTN1可利用免疫系統(tǒng)的先天和適應性“手臂”來抑制呼吸道炎癥。CNTN1可作為潛在的生物標志物，可能成為診斷和治療過敏性呼吸道炎癥的新策略。
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