HSF人皮膚成纖維細胞的應(yīng)用及傳代方法！

                                         HSF人皮膚成纖維細胞的應(yīng)用及傳代方法！
 
一、背景
 
HSF人皮膚成纖維細胞來源于人皮膚組織的貼壁細胞，貼壁生長形態(tài)為長梭形或多角形，支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性。培養(yǎng)條件需添加含胎牛的血清。
 
成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。
 
另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。體外培養(yǎng)的成纖維細胞多為梭形、多角形和扁平星形等，其形態(tài)尚可依細胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變。
 
電鏡下，其胞質(zhì)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達的高爾基復(fù)合體。處于成熟期或稱靜止狀態(tài)的成纖維細胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體均不發(fā)達。它具有較強的分裂增殖能力，適應(yīng)性強，是最容易培養(yǎng)的動物細胞類型之一。
 
貼壁細胞傳代方法：
 
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
 
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。
 
3、輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
 
4、移入到事先準備好的含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
 
二、應(yīng)用
 
用于絞股藍總皂苷對人皮膚成纖維細胞光老化模型凋亡信號通路的影響研究：
 
通過采用長波紫外線（UVA）輻射人體皮膚成纖維細胞（HSF），誘導(dǎo)細胞發(fā)生光老化現(xiàn)象后，采用不同濃度絞股藍總皂苷（Gyp）含藥血清進行干預(yù)，觀察各組皮膚細胞在增殖活性、ROS含量、細胞凋亡數(shù)量以及凋亡相關(guān)調(diào)控因子Bcl-2，Bax，Caspase-3mRNA和蛋白表達變化，探究Gyp干預(yù)光老化細胞凋亡作用相關(guān)分子機制，探索Gyp對HSF細胞光老化損傷有明確防治作用新靶點，為絞股藍作為靶點藥物用于防治人體皮膚光老化及相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)及實驗數(shù)據(jù)。
 
實驗材料：健康SPF級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠20只，體重200～250g。皮膚成纖維細胞株（HSF）；絞股藍總皂苷（MUST-11031401）；DMEM高糖培養(yǎng)液；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶；PBS緩沖液；二甲基亞砜（DMSO）；UVA光源（20W），紫外光光度計；MTT；細胞凋亡原位檢測試劑盒；水合氯醛；青/鏈霉素；無水乙醇；75%乙醇；兔抗人Bax、Bcl-2及內(nèi)參β-actin抗體；HRP標記的羊抗兔二抗；ECL發(fā)光試劑盒；Trizol；Bax、Bcl-2及內(nèi)參引物；PCR儀、電泳儀，凝膠成像分析系統(tǒng)；細胞蛋白提取試劑；BCA法蛋白定量試劑盒；ECL發(fā)光液；電熱恒溫振蕩器；酶標儀；凝膠成像分析系統(tǒng)；水平搖床；垂直板電泳裝置；電泳儀；轉(zhuǎn)印電泳槽等。
 
Gyp對光老化皮膚成纖維細胞增殖的影響：
 
1、絞股藍總皂苷（Gyp）含藥血清制備將20只SD大鼠按隨機數(shù)字法分為空白血清對照組和Gyp含藥血清組。含藥血清組給予Gyp粉末生理鹽水溶液（生藥質(zhì)量濃度為80mg Kg-1d-1）灌胃，空白血清對照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃7d。然后于腹主動脈采血，血液經(jīng)離心后分離出血清，凍存?zhèn)溆谩?br />  
2、人皮膚成纖維細胞（HSF）培養(yǎng)及光老化模型復(fù)制將HSF細胞株消化傳代。待倒置顯微鏡下觀察到細胞長滿瓶底時，放入冰箱中保存。造模時，取出凍存的HSF細胞，解凍后將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶，加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。
 
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