熒光定量PCR分析

基因表達(dá)的精確定量是通過ABI7000/7500,羅氏4800實(shí)時(shí)定量PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的，其主要原理是將目的片斷擴(kuò)增到一定量時(shí)需要的PCR循環(huán)數(shù)（Ct）跟加入的DNA模板濃度對(duì)數(shù)成線性相關(guān)。根據(jù)檢測(cè)熒光來源的不同，實(shí)時(shí)定量PCR可以分為兩種，一種是通過Taqman探針來實(shí)現(xiàn)，而另一種是通過SYBR嵌入DNA雙鏈發(fā)光原理來實(shí)現(xiàn)。兩種PCR體系都能產(chǎn)生高重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但Taqman探針的訂購需要較長(zhǎng)時(shí)間�；�因表達(dá)量的校正有兩種方式，一種通過比較候選基因與參照基因達(dá)到一定量擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)的Ct值來實(shí)現(xiàn)（ΔCt）， 另一種是利用標(biāo)準(zhǔn)樣本構(gòu)建濃度與Ct值相關(guān)曲線，分別確定候選基因與參照基因的絕對(duì)表達(dá)濃度，然后通過比較這兩個(gè)濃度值來確定候選基因相對(duì)參照基因的表達(dá)量。前一種方法由于不同基因片斷擴(kuò)增效率不等或擴(kuò)增效率未知，故不能準(zhǔn)確估計(jì)目標(biāo)基因相對(duì)參照基因的表達(dá)比例，對(duì)于后一種方法，可以去除不同基因片斷擴(kuò)增效率不等的影響，而且如果采用標(biāo)準(zhǔn)樣本，既可以準(zhǔn)確獲得目標(biāo)基因相對(duì)參照基因的表達(dá)比例，也可以準(zhǔn)確知道目標(biāo)基因在cDNA中的絕對(duì)含量。

本公司推薦采用SYBR定量PCR試劑以及利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的基因表達(dá)校正方法.

以下是該方法簡(jiǎn)要示意圖：

客戶需要提供：
1）用1μg DNase I純化后的總RN反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA，一般為20μl體系；
2）需要定量的目標(biāo)基因以及用于校正的參照基因信息。

我們提供的服務(wù)內(nèi)容：
1）SYBR實(shí)時(shí)定量PCR試劑的訂購；
2）定量PCR引物的設(shè)計(jì)、合成與優(yōu)化；DNA樣本的質(zhì)檢與標(biāo)化；
3）目的基因及參照基因的絕對(duì)定量PCR；
4）絕對(duì)定量數(shù)據(jù)的整理以及目標(biāo)基因相對(duì)參照基因的表達(dá)分析；
提供給客戶的結(jié)果報(bào)告將包括原始數(shù)據(jù)文件、實(shí)驗(yàn)步驟、絕對(duì)定量數(shù)據(jù)以及表達(dá)校正結(jié)果等
完成期限：
引物的設(shè)計(jì)、合成及優(yōu)化需10個(gè)工作日；1000個(gè)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系需5個(gè)工作日。
檢測(cè)費(fèi)用：請(qǐng)來電詢價(jià)
檢測(cè)實(shí)例：

Gene X 絕對(duì)定量界面