基因甲基化檢測

DNA甲基化檢測服務

 甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號碳原子上加上甲基的共價修飾過程.

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變DNA的一級結構，卻在細胞的發(fā)育、基因的表達、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。

CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機制。

因此，基因啟動子甲基化檢測在臨床診斷、藥物敏感性檢測、個性化治療等方面具有很高的應用價值。

該方法是檢測甲基化的經(jīng)典方法，也是最早采用的基因甲基化檢測方法。方法是：通過兩對引物，分別對應甲基化序列和非甲基化序列，對重亞硫酸鹽轉化后的DNA進行PCR擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析某個基因的甲基化情況。

  二. BSP（即亞硫酸鹽測序）：定量方法

該方法是通過PCR產(chǎn)物克隆測序，然后用甲基化分析軟件對測序序列與靶序列進行比對分析，可以得到如下數(shù)據(jù)：

1)  測序序列與靶序列的相似度；    2）轉化效率；

3) 靶序列中每個位點的甲基化情況（點狀圖）； 4）靶序列中每個位點的甲基化頻率（）

三. 高通量BSP檢測
 
    該方法將傳統(tǒng)的BSP與高通量測序（NGS）結合，既擴展了檢測片段長度，又提高了檢測準確性，實驗成本也較BSP有大幅度的降低。
實驗流程如下：
1. 實驗設計：選擇檢測區(qū)域（Promoter/DMR）
2. 引物設計及合成：根據(jù)選定的區(qū)域設計BSP引物（可分段設計）
3. DNA亞硫酸鹽轉化：
4. PCR擴增：用BSP引物將要檢測的片段擴增出來（可多重PCR）
5. PCR產(chǎn)物純化：
6. PCR產(chǎn)物建庫：將純化后的PCR產(chǎn)物構建DNA文庫
7. NGS測序：Illumina HiSeq, PE150；測序深度：>100X
8. 數(shù)據(jù)分析：單樣本甲基化譜，多樣本整合分析（統(tǒng)計分析），與基因表達數(shù) 據(jù)聯(lián)合分析。 

四. 焦磷酸測序法(Pyrosequencing):  定量檢測單個或相鄰的幾個CG位點的甲基化頻率

    在表觀遺傳學的DNA甲基化研究中，新一代的測序方法可得到大量的全基因組甲基化特征數(shù)據(jù)，需要驗證其中特定靶序列與表觀遺傳修飾的生理相關性。此驗證過程較具挑戰(zhàn)性，因為甲基化位點的位置和頻率的微小改變也會帶來明顯的變化。焦磷酸測序可在一次檢測中快速定量一個或多個甲基化位點，是理想的驗證方法。

       因此該技術在表觀遺傳學研究中逐漸成為數(shù)據(jù)分析的金標準。

    技術優(yōu)勢：

♦ Pyrosequencing 能測定鄰近CpG區(qū)域的單個甲基化水平，甚至包括測序的引物區(qū)域

♦ 啟動子序列中接近的不同CpG島的甲基化頻率計算

♦ 適用于新鮮冷凍，和石蠟包埋的樣本

♦ 不同的應用實驗可同時在一次運行中實現(xiàn)

♦ PCR反應之后，1個小時內可同時平行分析96個樣本

五. LUMA法： 定量檢測全基因組DNA甲基化水平，而不具體于特定的基因。

原理及方法如下：

基于在DNA甲基化分析中最常用的同裂酶對HpaII/MspI， Karimiet等人建立了全基因組DNA甲基化化學發(fā)光定量檢測技術（Luminometric methylation assay, LUMA）.該檢測方法以EcoRI作為內部參照。DNA將在兩個獨立酶切反應（MspI+EcoRI和HpaII+EcoRI）中消化。EcoRI酶切后在5’端留出-AATT-，而HpaII和MspI留出了-GC-序列。 然后采用焦磷酸測序平臺上的聚合酶擴增技術填充核苷酸到5’端。最后用數(shù)學公式計算出HpaII/MspI位點甲基化水平即量化為全基因組甲基化的百分比。

結果計算方法如下：