美國(guó)DeNovix公司超微量/熒光全功能光度計(jì)在新一代測(cè)序樣品質(zhì)量上的應(yīng)用

對(duì)于新一代測(cè)序，待測(cè)樣品的質(zhì)量和濃度，是文庫(kù)成功構(gòu)建的兩個(gè)非常關(guān)鍵因素，也是新一代測(cè)序成功與否的關(guān)鍵。它可以最大程度上減小序列的偏差，并且輸出可靠的序列信息。嚴(yán)格把關(guān)送測(cè)樣品的濃度和質(zhì)量，是確保新一代測(cè)序的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、以及高通量的關(guān)鍵。

紫外可見(jiàn)光全光譜掃描的微量模式

定量核酸的濃度是借助吸光度值來(lái)判斷的。核酸的吸收峰是在260nm，在該波長(zhǎng)下的吸光度值可以直接通過(guò)朗伯比爾定律計(jì)算得到濃度值。吸光度值還可以提示樣品的污染情況，依據(jù)不同的物質(zhì)混合在核酸溶液中造成吸收光譜中臨近260nm的位置發(fā)生變化。

對(duì)于基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)，超微量測(cè)量方式以測(cè)量快速，節(jié)省樣品（1ul或更少）更加受到科研人員的青睞。而且省去了稀釋樣品的環(huán)節(jié)。

定量核酸260nm的吸收峰值來(lái)判斷樣品濃度，但無(wú)法做到區(qū)分核酸的種類(lèi)。例如ssDNA, RNA, 寡核苷酸，這些物質(zhì)都會(huì)作為目標(biāo)dsDNA的污染物存在，并直接導(dǎo)致測(cè)量時(shí)260nm下的吸光度值增加，從而導(dǎo)致目標(biāo)dsDNA的濃度值被高估。所以紫外吸收法只針對(duì)于純化的樣品。

熒光定量方法

熒光定量方法是用熒光基團(tuán)有選擇性的結(jié)合目標(biāo)生物分子的性能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)熒光結(jié)合在靶標(biāo)上之后，熒光的強(qiáng)度即代表靶標(biāo)的濃度。

基于這種原理，將發(fā)射出來(lái)的熒光強(qiáng)度直接和溶液中生物分子的濃度相關(guān)聯(lián)。通過(guò)將熒光試劑與已知濃度的樣品混合，然后測(cè)量其相對(duì)熒光當(dāng)量（RFU），建立起一條濃度和RFU相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。那么，將待測(cè)樣品同樣和熒光試劑進(jìn)行混勻，檢測(cè)到的熒光信號(hào)RFU和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，得到待測(cè)樣品的準(zhǔn)確濃度。熒光試劑的特異性，是熒光法檢測(cè)樣品濃度的關(guān)鍵。保證研究者得到的數(shù)據(jù)是靶標(biāo)樣品的準(zhǔn)確濃度。

由于熒光基團(tuán)具有非常高的消光系數(shù)，熒光法通常更加精確。使用DeNovix 公司DS-11FX和dsDNA定量分析試劑盒，可以檢測(cè)到低至0.5 pg/uL的dsDNA母液樣品。這比紫外吸收法的測(cè)量下限降低了1000多倍。這個(gè)方法使測(cè)量的靈敏度顯著提高。

絕大多數(shù)的新一代測(cè)序服務(wù)商，都會(huì)建議客戶(hù)使用熒光試劑盒對(duì)送測(cè)樣品進(jìn)行定量，如DeNovix，PicoGreen，Qubit等。這些試劑盒中的染料特異性的結(jié)合在dsDNA結(jié)構(gòu)上，不會(huì)和其他核酸結(jié)合，從而保證得到的數(shù)值是溶液中dsDNA的準(zhǔn)確濃度，不會(huì)受到其他物質(zhì)的干擾。

樣品評(píng)估純度

除去精確定量濃度，還有一個(gè)重要的功能，就是排除潛在的酶抑制劑，如蛋白質(zhì)，EDTA，苯，鹽離子還有多聚糖等，都會(huì)給后續(xù)的酶促反應(yīng)帶來(lái)負(fù)面的影響。表現(xiàn)為降低產(chǎn)量，弱覆蓋率，甚至是文庫(kù)構(gòu)建的失敗。超微量全光譜掃描UV-VIS建議用來(lái)監(jiān)控樣品純度。通過(guò)評(píng)估260/280以及260/230的數(shù)值，樣品的純度以及混有的雜質(zhì)種類(lèi)即可知道。

結(jié)論

紫外可見(jiàn)光吸收法和熒光法雖然截然不同，但是都是進(jìn)行樣品定量的黃金法則。對(duì)于新一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)室，結(jié)合熒光法和紫外吸收法，只需要很少的量（1uL），就可以確保研究者獲得樣品的濃度和質(zhì)量信息。給后續(xù)實(shí)驗(yàn)以指導(dǎo)。

為了滿(mǎn)足新一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)室的研究需求，美國(guó)DeNovix新款DS-11FX/FX+結(jié)合了超微量吸收法和熒光法兩種檢測(cè)模式。檢測(cè)能力覆蓋了目前最寬的樣品濃度范圍。只需要購(gòu)買(mǎi)一臺(tái)儀器，即能滿(mǎn)足科研中，所有測(cè)量濃度的需求。已經(jīng)成為新一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)室必備儀器。