蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16助力開(kāi)發(fā)新型高致病性尼帕病毒納米顆粒疫苗

文獻(xiàn)轉(zhuǎn)載：科學(xué)家開(kāi)發(fā)出新型高致病性尼帕病毒納米顆粒疫苗

An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadly neutralizing antibodies and protects against lethal Nipah virus infection

翻譯整理：北京佰司特科技有限責(zé)任公司

 

2024年8月31日，武漢大學(xué)病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙海艷團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所鄧增欽團(tuán)隊(duì)合作在《npj Vaccines》雜志上發(fā)表題為“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadly neutralizing antibodies and protects against lethal Nipah virus infection”的研究論文。本研究以尼帕病毒G蛋白頭部域?yàn)榭乖�靶�?biāo)，成功開(kāi)發(fā)出一種新型的、安全有效的自組裝蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗能夠誘導(dǎo)抑制多種亨尼帕病毒感染的廣譜中和抗體，并對(duì)尼帕病毒感染的倉(cāng)鼠提供完全保護(hù)。

Zhou, D. et al. 

npj Vaccines 9, 158 (2024).

https://doi.org/10.1038/s41541-024-00954-5

 

01 前言

尼帕病毒（NiV）是一種負(fù)義單鏈RNA病毒，最初是在1998年至1999年馬來(lái)西亞和新加坡爆發(fā)期間分離和鑒定的。NiV感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的腦炎和呼吸道疾病，病死率高達(dá)75%。另外在幸存者中也觀(guān)察到長(zhǎng)期神經(jīng)系統(tǒng)疾病和NiV感染復(fù)發(fā)。目前，還沒(méi)有批準(zhǔn)的可用于人類(lèi)的疫苗或治療方法。NiV編碼一種病毒膜蛋白：糖蛋白（G），G蛋白位于病毒表面，負(fù)責(zé)受體識(shí)別和結(jié)合，受體結(jié)合后，G蛋白經(jīng)歷一系列構(gòu)象變化，完成與靶細(xì)胞的膜融合，從而幫助病毒進(jìn)入靶細(xì)胞并引發(fā)感染。此外，許多中和和保護(hù)性抗體主要針對(duì)G蛋白，表明G病毒蛋白是疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵抗原。最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種針對(duì)NiV感染的疫苗平臺(tái)，包括亞基疫苗、mRNAs、病毒樣顆粒（VLP）、病毒載體疫苗和DNA疫苗，但還沒(méi)有對(duì)自組裝納米粒子平臺(tái)進(jìn)行NiV感染評(píng)估。作為納米顆粒疫苗載體，鐵蛋白（Ferritin）可以自組裝成一個(gè)八面體籠，周?chē)�排列�?4個(gè)相同的亞基，并多價(jià)顯示抗原。納米粒子的抗原多聚化特性可能允許B細(xì)胞受體的多價(jià)結(jié)合，從而有利于B細(xì)胞活化和引發(fā)針對(duì)遞送抗原的強(qiáng)大免疫反應(yīng)。由于這些優(yōu)勢(shì)，該遞送系統(tǒng)已被廣泛用于針對(duì)不同傳染性病原體和腫瘤的疫苗開(kāi)發(fā)，包括流感疫苗、EB病毒疫苗和新冠肺炎疫苗。為引，來(lái)自武漢大學(xué)病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙海艷團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所鄧增欽團(tuán)隊(duì)于2024年8月合作在《npj Vaccines》上發(fā)表題為“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadly neutralizing antibodies and protects against lethal Nipah virus infection”的研究論文。

 

02 摘要

作者設(shè)計(jì)了一種基于鐵蛋白的自組裝納米粒子，在表面顯示NiV G頭部結(jié)構(gòu)域（NiV G-鐵蛋白，NiV G-ferritin），并評(píng)估了可溶性NiV G頭結(jié)構(gòu)域（NiV sG）或NiV G-鐵蛋白引發(fā)的免疫反應(yīng)，并且通過(guò)一系列研究數(shù)據(jù)表明NiV G鐵蛋白是一種安全有效的尼帕病毒感染候選疫苗。

 

03 結(jié)果

NiV G納米顆粒免疫原的設(shè)計(jì)和生成先前的研究表明，受體結(jié)合位點(diǎn)位于NiV G頭部結(jié)構(gòu)域（Niv G head domain）上，大多數(shù)中和抗體和保護(hù)性單克隆抗體都以該結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)。為了在鐵蛋白（ferritin）表面均勻顯示NiV G頭部結(jié)構(gòu)域，將NiV G的C端與鐵蛋白的N端延伸融合，將信號(hào)肽融合到NiV G頭部結(jié)構(gòu)域的N端，在Expi293F細(xì)胞中進(jìn)行真核分泌表達(dá)。作者通過(guò)負(fù)染電子顯微鏡（Negative stain EM）檢查了ferritin和NiV G-ferritin的整體結(jié)構(gòu)。Negative stain EM圖顯示，ferritin和NiV G-ferritin都形成了分散的球形顆粒，沒(méi)有聚集的跡象，與單獨(dú)的ferritin相比，NiV G-ferritin的表面呈尖峰狀。

作者進(jìn)一步借助北京佰司特科技有限責(zé)任公司自主研發(fā)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，通過(guò)差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進(jìn)行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現(xiàn)出相似的熱穩(wěn)定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性沒(méi)有顯著影響。

由于NiV G-ferritin可以誘導(dǎo)強(qiáng)大的體液免疫反應(yīng)，研究者還從NiV G-ferritin免疫小鼠體內(nèi)篩選、制備了一批單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）。在分離的27種mAbs中，25種mAbs可以有效抑制水皰性口炎病毒（VSV）為骨架的NiV假病毒的感染，其抑制50%的NiV假病毒感染所需要的濃度（IC50）低于10 ng/mL。表位競(jìng)爭(zhēng)分析發(fā)現(xiàn)，篩選得到的27個(gè)mAbs可以識(shí)別NiV G蛋白上4個(gè)不同的抗原表位，包括2個(gè)新的此前未被報(bào)道的表位。最后，研究者在尼帕病毒感染的致死模型（敘利亞金黃倉(cāng)鼠）上評(píng)估了NiV G-ferritin誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和保護(hù)效果。研究發(fā)現(xiàn)給與倉(cāng)鼠2針或者3針的NiV G-ferritin后，倉(cāng)鼠體內(nèi)均產(chǎn)生了高中和活性的血清，且接種2次或者3次均能夠幫助倉(cāng)鼠100%的抵抗致死劑量NiV的攻擊。研究者進(jìn)一步檢測(cè)了3針疫苗接種倉(cāng)鼠體內(nèi)的病毒RNA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，倉(cāng)鼠的肺臟、腦和脾臟中均未檢測(cè)到病毒RNA，表明三劑NiV G-ferritin完全抑制了病毒在倉(cāng)鼠肺部、大腦和脾臟的復(fù)制。
 

04 方法

克隆、蛋白表達(dá)和純化

編碼NiV-M的基因G (NP_112027.1)和F (NP_112026.1) NiV-B的基因(AAY43916.1)和F (AAY43915.1)， G (NP_047112.2)和F (NP_047111.2) of hev,G(YP_009094095.1) of mojv,G(UUV47206.1) of LayV，幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白(WP_000949190.1)和牛蛙鐵蛋白 ESQVRQQF基因片段(ESQVRQQF)的密碼子經(jīng)Tsingke優(yōu)化合成 niv - m、NiVB、 將HeV分別克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中 用于生成假病毒。

負(fù)染色電子顯微鏡

純化后的納米顆粒依次稀釋至800/400/200/100/50 nM 然后將10 μL的樣品吸附在300目銅網(wǎng)(北京 大集科易科技有限公司(D11023)靜置1 min，然后，將多余溶液 被濾紙吸走了。網(wǎng)格用2%鈾酰染色 醋酸鹽浸泡30 s，吸去多余的溶液。圖片是 通過(guò)透射電子顯微鏡(JEOL, JEM-1400plus)收集 或Talos L120C (Thermo Scientific)電子顯微鏡。

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)

蛋白用0.22 μm濾鏡過(guò)濾，稀釋至約 0.5mg/mL，使用含有20mMTris-HCl pH 8.0和150mM的緩沖液 生理鹽水。然后，將樣品裝入微比皿中測(cè)量 Zetasizer納米ZSP的水動(dòng)力直徑和多分散性?xún)x器(馬爾文帕analytical)。每個(gè)樣品重復(fù)三次 在25°C下，每次平行重復(fù)持續(xù)60 s。水動(dòng)力的 對(duì)樣品的直徑和多分散性指數(shù)進(jìn)行了分析(Malvern Panalytical)。  

差示掃描熒光法

使用PSA-16儀器（北京佰司特科技有限責(zé)任公司）通過(guò)差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）測(cè)定靶蛋白的熱穩(wěn)定性。將樣品稀釋至0.5mg/mL，并將20μL稀釋后的樣品裝入石英玻璃管中。使用23至97°C的線(xiàn)性溫度掃描，以1°C/min的加熱速度實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測(cè)量靶蛋白在280nm紫外激發(fā)下的330nm和350nm的熒光強(qiáng)度（F）。根據(jù)F350nm/F330nm曲線(xiàn)的斜率計(jì)算熱變性中點(diǎn)溫度（thermal transition midpoint，Tm）。每個(gè)樣品平行測(cè)量四次。

多角度光耦合的粒徑排除色譜法散射(SEC-MALS)

每個(gè)樣品100 μL體積(NiV g -鐵蛋白0.5mg/mL, 2mg/ mL) mL (NiV sG)注入WTC-030S5色譜柱(Wyatt Technology， Santa Barbara, CA, USA)，等溫運(yùn)行0.5 mL/min 以20mMTris-HClpH8.0和150mmnacl為移動(dòng)端 階段。一個(gè)MALS檢測(cè)器(DAWN®)和一個(gè)折射率檢測(cè)器(RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA)串聯(lián)到 SEC系統(tǒng)上的紫外線(xiàn)探測(cè)器。牛血清白蛋白(BSA 采用Scientific)對(duì)靜態(tài)光散射探測(cè)器進(jìn)行歸一化處理。光 散射，差折射率(dRI)測(cè)量，和分子 采用ASTRA軟件(6.1.2.84)(Wyatt Technology)。  

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

采用ELISA法檢測(cè)NiV g -鐵蛋白的抗原性。簡(jiǎn)單地說(shuō),96 - 用3 μg/mL的NiV在4℃下包被ELISA板(康寧)過(guò)夜 sG或NiV g -鐵蛋白涂層緩沖液(0.1Mcarbonate, pH9.6)。后四個(gè) 用PBS-T(pbs含0.05%Tween 20)沖洗1次后，所有的孔都被堵塞 用50 μL阻斷緩沖液(PBS-T中1% BSA)在37℃下作用2 h。后 阻斷，NiV G單抗HENV-32, HENV-26, nAH1.3，抗狂犬病 病毒單抗RVC20(陰性對(duì)照)從5 μg/mL開(kāi)始依次稀釋 加入板中，37℃孵育2 h PBS-T洗滌4次，然后加入HRP結(jié)合的山羊抗人抗體 IgG(1∶20000稀釋?zhuān)琣b克隆，AS002)在37℃下保存1 h。盤(pán)子 用50 μL/孔的單組份TMB顯色劑沖洗染色 溶液(NCMBiotech)在37°C下保存10-30分鐘。底物反應(yīng) 加入50 μL/孔的1M HCl，吸光度為 在450nm處測(cè)量(OD450)。對(duì)于血清結(jié)合滴度檢測(cè)，我們 NiV-M、NiV-B、NiV-B的G頭蛋白 將HeV、LayV和MojV包被在ELISA板上，HRP偶聯(lián) 采用山羊抗小鼠IgG(1∶8000稀釋?zhuān)琣b克隆，AS003)。  
 

作者也致謝了北京佰司特科技有限責(zé)任公司，提供自主研發(fā)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，獲得蛋白樣品熱穩(wěn)定性分析的數(shù)據(jù)。
 

05 總結(jié)

綜上，本研究成功設(shè)計(jì)了一種以NiV G蛋白頭部域?yàn)榭乖�靶�?biāo)，以ferritin為展示平臺(tái)的新型納米顆粒候選疫苗，并分離了一批具有潛在治療效果的單克隆抗體。研究為深入理解尼帕病毒G蛋白的免疫原性提供了新的見(jiàn)解，NiV G-ferritin有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為亨尼帕病毒的廣譜候選疫苗，為全球公共衛(wèi)生安全提供新的防護(hù)策略。

武漢大學(xué)病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙海艷研究員和中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所鄧增欽研究員為該論文的共同通訊作者。武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生周丹、已畢業(yè)的碩士研究生程嬈以及中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所高級(jí)實(shí)驗(yàn)師姚艷豐博士為論文的共同第一作者。

該研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、湖北省衛(wèi)生健康委青年人才項(xiàng)目和中國(guó)科學(xué)院院級(jí)人才項(xiàng)目的資助，并獲得武漢國(guó)家生物安全實(shí)驗(yàn)室和武漢病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的支持。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5

 

06 蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16

北京佰司特科技有限責(zé)任公司于2023年推出了自主研發(fā)的第一款國(guó)產(chǎn)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16。

PSA-16的性能和參數(shù)達(dá)到進(jìn)口設(shè)備的水平，價(jià)格卻遠(yuǎn)低于進(jìn)口產(chǎn)品，彌補(bǔ)了目前國(guó)產(chǎn)自主設(shè)備在蛋白穩(wěn)定性研究分析領(lǐng)域的空白。

主要參數(shù)★ 測(cè)定參數(shù)：Tm、Cm、ΔG等；

★ 樣品通量：16個(gè)；

★ 樣品體積：≤20 uL；

★ 濃度范圍：0.01-200 mg/ml；

★ 溫控范圍：15-110度；

★ 變溫速度：0.1-15度/分鐘；

★ Tm重復(fù)性：CV小于1%；

★ 耗材參數(shù)：一次性，無(wú)需清洗；

★ 八聯(lián)排設(shè)計(jì)，適配多通道移液器；
 

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16基于內(nèi)源差示掃描熒光（ifDSF）技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究、蛋白質(zhì)類(lèi)大分子藥物（抗體）優(yōu)化工程、蛋白質(zhì)類(lèi)疾病靶點(diǎn)的藥物小分子篩選和結(jié)合力測(cè)定等領(lǐng)域，具有快速、準(zhǔn)確、高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)中色氨酸/酪氨酸的熒光性質(zhì)與它們所處的環(huán)境息息相關(guān)，因此可以通過(guò)檢測(cè)蛋白內(nèi)部色氨酸/酪氨酸在加熱或者添加變性劑過(guò)程中的熒光變化，測(cè)定蛋白質(zhì)的化學(xué)和熱穩(wěn)定性。

PSA-16采用紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)技術(shù)，可精準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)去折疊過(guò)程中色氨酸和酪氨酸熒光的變化，獲得蛋白的Tm值和Cm值等數(shù)據(jù)；測(cè)定時(shí)無(wú)需額外添加染料，不受緩沖液條件的限制且測(cè)試的蛋白質(zhì)樣品濃度范圍非常廣（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可廣泛用于去垢劑環(huán)境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩(wěn)定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數(shù)據(jù)采集速度，從而可提供超高分辨率的數(shù)據(jù)。同時(shí)PSA-16一次最多可同時(shí)測(cè)定16個(gè)樣品，通量高；每個(gè)樣品僅需要15 uL，樣品用量少，非常適合進(jìn)行高通量篩選。PSA-16操作簡(jiǎn)單，使用后無(wú)需清洗，幾乎無(wú)維護(hù)成本。

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16應(yīng)用涵蓋植物、生物學(xué)、動(dòng)物科學(xué)、動(dòng)物醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、工業(yè)發(fā)酵、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)、蛋白質(zhì)工程等多學(xué)科領(lǐng)域。蛋白質(zhì)是最終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程�，F(xiàn)代分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、動(dòng)醫(yī)動(dòng)科、農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)等多種學(xué)科研究的很多方向都涉及蛋白質(zhì)功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學(xué)方法分析，提供穩(wěn)定的蛋白質(zhì)樣品是所有蛋白質(zhì)研究的先決條件。因此多功能蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析系統(tǒng)在各學(xué)科的研究中都有基礎(chǔ)性意義。

1.    抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選

2.    抗體或疫苗、酶制劑的化學(xué)穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估、等溫穩(wěn)定性研究等

3.    生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗體偶聯(lián)藥物（ADC）研究

5.    多結(jié)構(gòu)域去折疊特性研究

6.    物理和化學(xué)條件強(qiáng)制降解研究

7.    蛋白質(zhì)變復(fù)性研究（復(fù)性能力、復(fù)性動(dòng)力學(xué)等）

8.    膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結(jié)合配體篩選（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶標(biāo)的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白純化條件快速優(yōu)化等

 

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