酵母表達系統(tǒng)

·酵母表達系統(tǒng)——步驟1. 目標基因亞克隆至酵母表達載體：
擴增并抽提含有目標基因的載體質(zhì)粒。
將目標基因亞克隆到合適的表達質(zhì)粒上。
測序驗證構(gòu)建質(zhì)粒的準確性。
可提供表達載體：pPICZα和pPIC9K
提供客戶：正確構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測序報告。
服務(wù)周期：1周

·酵母表達系統(tǒng)——步驟2. P. Pichia表達菌株電轉(zhuǎn)化：
酶切線性化表達質(zhì)粒。
將表達質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化到高效的P. Pichia表達菌株中。
利用蛋白酶去除不需要的純化標簽（Tag），再純化獲得所需的目標蛋白（可選，構(gòu)建表達載體時需加入合適的蛋白酶切位點）。
通過PCR鑒定至少挑選5個陽性克隆。
可提供表達菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168。
提供客戶：PCR陽性克隆及PCR結(jié)果報告。
時間：1周

· 酵母表達系統(tǒng)——步驟3. P. Pichia表達菌株篩選：
將5個陽性克隆于BMGY培養(yǎng)基中擴增，然后換至BMMY培養(yǎng)基中，并加入甲醇誘導(dǎo)表達目標蛋白。
SDS-PAGE電泳檢測培養(yǎng)上清中目標蛋白的表達情況，并挑選合適的單克隆菌株用于目標蛋白的表達。
如果培養(yǎng)上清中檢測不到表達，則通過將上清濃縮20倍作用再檢測，或通過Western-blot方法檢測目標蛋白表達（客戶需要提供相關(guān)抗體）。
提供客戶：任意一個客戶需要的陽性克隆菌株及表達篩選結(jié)果報告。
時間：2周

·酵母表達系統(tǒng)——步驟4. P. Pichia表達菌株表達優(yōu)化：
挑選20個陽性克隆進行常規(guī)表達篩選，并對其中表達最好菌株優(yōu)化表達條件。
對挑選出來的單克隆菌株，優(yōu)化培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件（培養(yǎng)基，菌體密度，甲醇濃度，誘導(dǎo)時間等），提高目標蛋白的表達量。
提供客戶：任意三個客戶需要的陽性克隆菌株及優(yōu)化表達條件結(jié)果報告。
時間：2周

·酵母表達系統(tǒng)——步驟5.目標蛋白表達及純化：
搖瓶培養(yǎng)1L重組酵母菌，誘導(dǎo)表達目標蛋白。
通過親和，離子交換，疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。
通過SDS-PAGE電泳檢測每步結(jié)果并控制最終產(chǎn)品質(zhì)量。
通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。
提供客戶：純化好的目標蛋白1~10mg及純化報告�？砂纯蛻粢�求提供含純化標簽（Tag）或切除純化標簽（Tag）的最終蛋白，純度最高可達90%以上。
時間：2~3周

備注：
1. 如果沒有獲得目標蛋白，則不收取任何費用。如果最終得到的產(chǎn)品未達到合同要求而客戶又同意接受該產(chǎn)品，則雙方協(xié)商本步驟費用（給予客戶20%~50%折扣）。
2. 如果客戶需要詳細的純化工藝，包括詳細純化條件及每步結(jié)果，則需要加收100%相應(yīng)費用。
3. 因為每個重組蛋白的表達量及純化得率都不相同，我們最終根據(jù)實際情況將給客戶提供最少1mg，最多10mg的目標蛋白，所收取的費用是相同的。
4. 我們提供的最終產(chǎn)品一般為保存于常規(guī)的緩沖液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸鈉緩沖液）中蛋白質(zhì)溶液，并且其中不含有尿素或鹽酸胍等變性劑。但因為我們無法為每個定制的蛋白建立活性檢測系統(tǒng)，所以我們無法保證最終產(chǎn)品的生物學(xué)活性，不過我們承諾將會按照最大可能保護其活性的方法來制備目標蛋白。 如果客戶一定要求目標蛋白活性，我們可以先提供約50μg純化后樣品供客戶檢測活性。若樣品活性不合格，我們不再提供目標蛋白給客戶并只收取本步驟費用的30% ，而如果樣品活性合格，我們將提供合同要求的相同質(zhì)量的目標蛋白給客戶并需要加收本步驟費用的100%。
5. 每次Western-blot檢測最多7個樣品，因為要加入陽性對照，陰性對照以及Marker。本步驟只包含一次免費檢測，如果需要更多次檢測則需另收費。我們可以免費為客戶提供抗His-tag的一抗，如果客戶需要使用其他一抗，則需要客戶提供。另外由于Western-blot檢測結(jié)果受很多客觀因素影響，因此我們并不能確保檢測結(jié)果（可能會出現(xiàn)假陽性或是假陰性的結(jié)果）。如果結(jié)果不正常，我們可以免費重做一次。

·酵母表達系統(tǒng)——步驟6.目標蛋白的再加工及詳細檢測
對生物學(xué)活性要求較高的純化后蛋白產(chǎn)品進行復(fù)性研究。
內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進一步加工。
通過HPLC，質(zhì)譜等方法詳細檢測目標蛋白的質(zhì)量。
服務(wù)內(nèi)容：
1.復(fù)性研究：
利用多達18種不同復(fù)性緩沖液的體系，對目標蛋白進行小量復(fù)性試驗提供復(fù)性后樣品供客戶檢測。
可根據(jù)客戶要求，按照其中一種樣品的復(fù)性條件制備小量的復(fù)性蛋白。
可提供具體的復(fù)性緩沖液配方及復(fù)性工藝。
2.除內(nèi)毒素
3.過濾除菌
4.凍干
5.HPLC檢測
6.質(zhì)譜檢測
提供客戶：加工后的終產(chǎn)品及相關(guān)實驗和檢測報告。
時間：1~2周
 

·酵母表達系統(tǒng)——步驟7. 大規(guī)模制備
提供客戶：合格的目標蛋白及服務(wù)報告。。
時間： 協(xié)商
 

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